拟南芥四个雄配子体和一个雄性不育突变体的分离和分子遗传研究

摘要

雄配子体在被子植物有性生殖过程中起着重要作用，然而目前已知的参与调节雄配子体发育和功能的基因还很少。本文通过统计拟南芥幼苗卡那霉素(选择性标记)抗性与敏感性分离比，从Ds插入突变体库中筛选到四个偏离孟德尔分离比的突变体：KD360、KD361、KD362、KD375。正反交实验表明KD360、KD362和KD375仅影响雄配子体的传递，而KD361既影响雄配子体传递又影响雌配子体传递；KD362完全不能通过雄配子体传递，而KD360、KD361和KD375仅部分不能通过雄配子体传递。形态学和细胞学研究表明KD360、KD361和KD375雄配子体败育发生在单核时期，而KD362雄配子体败育发生在两核之后三核之前。基因克隆显示KD360 Ds插入到Atlg44224唯一的外显子内，预测Atlg44224编码ECAl配子体发生相关蛋白。KD361 Ds插入到At4g00380 ATG上游1bp处。预测At4g00380编码含XH/XS元件或XS锌指元件蛋白。KD362有两个Ds插入，一个插入到At2g01560第一个外显子内，另一个插入到At2g01910和At2g01913之间，距At2g01910终止密码子TGA下游460bp，距At2g01913终止密码子TTA下游1284bp。KD375 Ds插入到Atlg26815 ATG上游134bp处。预测Atlg26815编码的蛋白含有一个F-box结合区域和一个跨膜元件。通过Ds插入位点纯杂合鉴定以及等位突变体分析我们推测：Atlg44224和At4g00380突变可能是KD360和KD361雄配子体部分致死的原因，即Atlg44224和At4g00380可能参与调控拟南芥雄配子体发育；KD362雄配子致死表型可能是Ds插入导致At2g01913突变造成；KD375雄配子体部分致死表型与Atlg26815上游的Ds插入紧密连锁。Pro∷GUS转基因植株Gus染色结果表明：Atlg44224在小孢子、成熟花粉粒、萌发的花粉粒、柱头、以及早期胚胎中表达；At4g00380在四分体、小孢子、成熟花粉粒、萌发的花粉粒、柱头以及果荚中表达。
　　 此外我们得到一个新的雄性不育突变体ms360。刚从四分体释放出来的ms360小孢子外壁呈颗粒状，小孢子不能正常发育成花粉粒。此外ms360绒毡层的发育也不正常。遗传分析确定ms360是由单基因控制的隐性突变体。采用图位克隆技术，将MS360定位在拟南芥第三号染色体分子标记nga162和nga172附近。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

第一部分 前言

一、植物雄配子体的发生与发育

1.小孢子母细胞的形成和花药壁的发育

2.小孢子发生(microsporogenesis)

3.雄配子体发生(male gametogenesis)

4.成熟花粉

二、植物雄性生殖细胞发育的遗传调控

1.小孢子母细胞分化的遗传调控

2.小孢子母细胞减数分裂的遗传调控

3.雄配子发育的遗传调控

三、拟南芥雄性不育研究进展

四、本实验研究研究的目的和意义

第二部分 材料和方法

一、材料

1.植物材料

2.载体和菌株

3.工具酶和试剂

4.常用抗生素配方

5.主要仪器

二、常用染液和培养基配方

1.常用染液配方

2.常用培养基配方

三、实验方法

1.雄配子突变体筛选和种植

2.突变体表型观察

3.突变体的回交实验及遗传分析

4.Tail-PCR克隆突变基因

5.纯杂合鉴定

6.全长基因克隆、分子互补载体构建以及转化相应突变体拟南芥

7.启动子克隆、Pro∷GUS载体构建及转化野生型拟南芥

8.全长cDNA克隆，P35s∷cDNA∷GFP载体构建，转化野生型和突变体拟南芥

9.At2g01560和At1g26815 RNAi载体构建，及转化野生型拟南芥

10.雄性不育的基因定位

第三部分 实验结果

一、雄配子体突变体研究

1.雄配子体突变体的初筛

2.雄配子体突变体遗传学分析

3.KD360表型及基因分析

4.KD361表型和基因分析

5.KD362表型和基因分析

6.KD375表型和基因分析

二、拟南芥雄性不育突变体分析

1.拟南芥雄性不育突变体的获得及遗传分析

2.ms360表型分析

3.ms360基因粗定位a

第四部分讨论

一、KD360是一个雄配子体部分致死突变体

1.KD360自交分离比

2.KD360与野生型拟南芥正反交分析

3.KD360表型分析

4.Atlg44224可能参与调控雄配子体发育

5.Atlg44224组织定位

二、KD361是一个雄配子体部分致死突变体

1.KD361分离比

2.KD361与野生型拟南芥正反交分析

3.KD361表型分析

4.At4g00380可能参与调控雄配子体发育

5.At4g00380组织定位

三、KD362是一个雄配子体致死突变体

1.KD362分离比

2.KD362与野生型拟南芥正反交分析

3.KD362表型分析

4.KD362可能参与调控雄配子体发育

四、KD375是一个雄配子体部分致死突变体

1.KD375分离比

2.KD375与野生型拟南芥正反交分析

3.KD375表型分析

4.KD375可能参与调控雄配子体发育

五、ms360可能是一个新的雄性不育突变体

1.ms360遗传学分析

2.ms360表型分析

3.ms360基因分析

第五部分结论和展望

参考文献

附录

研究成果

致谢