生物钟基因表达在基础药理、毒理学研究的意义

摘要

本文对生物钟基因表达在基础药理、毒理学研究的意义进行了探讨。本研究分为四个部分：
　　第一部分：人原发性肝癌中金属巯蛋白和生物钟基因表达紊乱。
　　目的：生物钟紊乱与许多疾病的发生和发展密切相关，但是对人原发性肝癌生物钟的表达鲜有报道。本课题组前期研究表明，与肝癌相关的金属巯蛋白基因表达呈明显生物节律的变化，因此，本实验探究肝癌患者的癌组织和癌旁组织中金属巯蛋白和生物钟基因的表达。
　　方法：本实验的标本皆由北京解放军医院东方肝移植中心提供，包括36例健康的肝组织、24例肝癌患者的癌旁组织和癌组织。提取样品组织的RNA通过实时荧光定量方法（RT-qPCR）检测人原发性肝癌组织中金属巯蛋白和生物钟基因的表达。
　　结果：与正常肝组织相比，在肝癌组织和癌旁组织中，金属巯蛋白基因MT-1、MT-2和MFT-1表达下降，且在肝癌组织中金属巯蛋白基因表达下降最多。生物钟核心基因Bmal1、Clock和生物钟负反馈基因Per1、Per2、Cry1、Cry2在癌组织及与其相对的癌旁组织中表达也均下降，且在癌组织中表达下降最多。相反地，在癌组织及其相对的癌旁组织中，生物钟钟控基因Nr1d1和Dbp的表达上升。
　　结论：该研究发现，在原发性肝癌的癌组织和癌旁组织中，金属巯蛋白和生物钟基因表达紊乱，这可能为原发性肝癌的防治提供新思路。
　　第二部分：重复锰暴露诱导下丘脑和肝脏中生物钟基因表达的紊乱。
　　目的：金属锰（Mn）具有神经毒性，其症状表现为非运动障碍和运动障碍，也被称为锰中毒，其中运动障碍表现为帕金森样（PD）症状。帕金森病人和锰中毒患者均表现生物节律的紊乱，时钟基因是唯一驱动和维持生物节律的基因。但是，重复Mn暴露对生物钟基因表达的影响却知之甚少，因此本实验探究了生物钟基因在锰中毒的SD大鼠下丘脑和肝脏中的表达。
　　方法：雄性SD大鼠腹腔注射MnCl2·4H2O，给药剂量分别为1 mg/kg和5 mg/kg。隔天给药，每天给药一次。给药四周后，进行转棒实验。给药30天后，取脑和肝脏组织，通过RT-qPCR法检测生物钟基因的表达。通过免疫组化法，检测中脑黑质内多巴胺神经元的变化和皮质中小胶质细胞的变化。
　　结果：重复锰暴露引起神经毒性，导致中脑黑质内多巴胺神经元数量减少、小胶质细胞激活，且呈现剂量依赖型。在锰中毒大鼠的下丘脑和肝脏中，生物钟核心基因Bmal1、Clock、Npas2和生物钟负反馈基因Cry1、Per1、Per2表达降低，且随着给锰剂量的增加，生物钟核心基因和负反馈基因的表达下降更明显。然而，生物钟靶基因Dbp、Nr1d1在锰中毒大鼠的下丘脑和肝脏中表达却增加。
　　结论：重复锰暴露可以引起下丘脑和肝脏的生物钟基因表达紊乱，肝脏生物钟基因对锰中毒引起的时钟基因表达紊乱更具有易感性。
　　第三部分：慢性脂多糖和鱼藤酮诱导的帕金森模型大鼠伴随生物钟基因和蛋白的表达异常。
　　目的：脂多糖诱导的慢性神经炎症加重鱼藤酮的神经毒性，成功模拟帕金森疾病的模型。生物钟紊乱与许多神经退行性疾病相关。因此本部分实验研究在帕金森模型大鼠中，生物钟基因和蛋白的表达。
　　方法：雄性SD大鼠（约180 g），在LPS（5 mg/kg, ip x1）注射200天后，腹腔注射鱼藤酮（0.5 mg/kg, sc x20，5次/周）4周。给予鱼藤酮3周后，进行行为学检测，包括转棒实验、旷场实验、Y迷宫实验。末次给药10天后取大脑组织，免疫组化检测（TH染色和OX42染色）和大脑皮质线粒体活性检测，确定帕金森模型造模的成功，在此基础上通过RT-qPCR方法检测生物钟基因和蛋白的表达变化，
　　结果：在脂多糖和鱼藤酮联合诱导的慢性帕金森模型中，大鼠的运动功能受到损伤，在转棒实验中，与对照组相比，Rot组和L+R组大鼠在棒上停留时间下降了25.6％；旷场实验中，Rot组和L+R组大鼠运动距离下降了54%；在Y迷宫实验中，L+R组大鼠自发性选择正确率下降了30%。大脑皮质组织中线粒体活性检测发现，与对照组相比，LPS组、Rot组、LPS+Rot组线粒体活性均降低，且LPS+Rot组线粒体活性降低最多。与对照组相比，单独给与LPS或Rot和LPS+Rot联合用药使生物钟核心基因Bmal1、Clock、Npas2，生物钟负反馈基因Per1、Per2、Cry1、Cry2，生物钟靶基因Nr1d1、Dbp以及生物钟蛋白BMAL1、CLOCK、NR1D1、DBP表达均降低，且在LPS+Rot联合用药组，生物钟基因和蛋白下降最明显，并且差异具有统计学意义。
　　结论：脂多糖和鱼藤酮联合给药可以成功模拟帕金森模型，帕金森疾病大鼠大脑皮质生物钟基因和蛋白的表达紊乱。
　　第四部分：藏药佐太对小鼠肝脏生物钟基因的影响。
　　目的：生物钟在维持机体内环境的稳态和代谢方面起着重要作用。生物钟可以影响药物代谢，药效和毒理作用。相反地，药物也可以影响生物钟的表达。佐太是藏药的珍宝药，具有镇静，解毒，减毒增效的作用。但是佐太的药理作用尚不清楚，因此，本实验探究藏药佐太对生物钟的影响，为寻找佐太药理作用的靶点提供新思路。
　　方法：60只雄性昆明种小鼠购买于第三军医大学动物中心，随机分为12个组，每组5只。在SPF级动物房适应性饲养一周后，选7-12组给予佐太，给药剂量为10 mg/kg，连续给药7天，同时，1-6组每天给予生理盐水。七天后，先将小鼠麻醉，分别于6:00、10:00、14:00、18:00、22:00和2:00取肝脏组织。不同时间点取的肝组织分别提取总RNA，通过RT-qPCR检测生物钟基因的表达。
　　结果：藏药佐太降低10点肝脏生物钟核心基因Clock，Npas2，Bmal1的表达。对生物钟负反馈基因Cry1，Per1，Per2和Per3表达无影响。佐太增加Dbp基因在10点的表达，减少Nfil3基因在10点的表达，增加Nr1d1基因在18点的表达，但是对Tef，Nr1d2，RORa基因表达无影响。
　　结论：藏药佐太在一定程度上影响小鼠肝脏生物钟核心基因和靶基因基因在某些时间点的表达，但是不改变生物钟基因表达的整体节律。

目录

声明

中英文缩略词对照表

前

1 疾病与生物钟

2 生物钟与毒物

3 生物钟与药物

第一部分 人原发性肝癌中金属巯蛋白和生物钟基因表达紊乱

前言

1材料与方法

2 结果

3 讨论

4结论

第二部分 重复锰暴露诱导下丘脑和肝脏中生物钟基因表达的紊乱

前言

1材料与方法

2 结果

3讨论

4结论

第三部分 慢性脂多糖和鱼藤酮诱导的帕金森模型大鼠伴随生物钟基因和蛋白的表达异常

前言

1材料与方法

2结果

3 讨论

4 结论

第四部分 藏药佐太对小鼠肝脏生物钟基因的影响

前言

1材料与方法

2结果

3讨论

4 结论

参考文献

综述：生物钟基因-中药作用的新靶点

致谢

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