拟南芥核质转运载体AtTRN1底物筛选及AtTRN1表达量下降突变体sic1多分枝表型的研究

摘要

在真核生物中，蛋白质的入核转运对于维持细胞正常的生命活动具有极其重要的意义。Transportin1（TRN1）是核质转运蛋白importin家族一个成员,在酵母以及哺乳动物的研究中，TRN1能够识别一部分特殊的入核转运信号 PY-NLS，并且在酵母和哺乳动物中已经找到很多具有PY-NLS基序的TRN1的底物。最近的研究发现，人类TRN1蛋白的底物参与到多种的细胞活动中，包括RNA前体的可变剪切，RNA的跨核运输，基因转录的调控以及蛋白的合成。但Transportin1在植物细胞中底物及其功能研究却很少。
　　1.研究筛选了AtTRNl的底物，获得了以下结果：
　　1).以AtTRNl为诱饵筛选已建立的拟南芥cDNA酵母双杂交文库,寻找到18个与AtTRNl相互作用的蛋白，可能为AtTRNl的底物。通过对这些蛋白氨基酸序列的比对，我们没有发现PY-NLS基序。
　　2).利用已知的kapβ2和kap104p的底物，找出其在拟南芥中的同源蛋白，测试这些同源蛋白是否与AtTRNl互作，找出7个蛋白可能为AtTRNl的底物。
　　3).利用PY-NLS基序的公式在拟南芥蛋白组中比对出一些含有PY-NLS基序的蛋白，并验证了这些蛋白与AtTRNl之间的互作，发现了4个蛋白可能为AtTRNl的底物。
　　4).酵母双杂和双分子荧光互补实验验证了以上29个蛋白与AtTRNl之间存在着相互作用。通过蛋白质截短实验，发现AtTRNl可识别具有PY-NLS基序的片段。
　　2.研究了AtTRNl表达量下降的突变体sic1分枝增多的原因。主要的结果如下：
　　1).sic1植株具有明显多于WT型的莲座叶分枝和茎生分枝，但是通过半薄切片和扫描电镜发现 sic1植株的顶端分生组织并没有什么特殊的变化，并且 sic1植株的莲座叶节数目与野生型差不多，这些结果表明sic1植株中腋芽的休眠被打破从而导致了分枝数目增多
　　2).对sic1植株添加不同浓度的外源生长素，并且在sic1植株中过表达内源生长素合成基因YUCCA4，分别统计处理后和双突的分枝数目，发现这两种方法都可以有效的降低sic1植株莲座叶分枝和茎生分枝的数目，这说明生长素仍然能抑制sic1植株中分枝的向外生长，保持腋芽的休眠。
　　3).细胞分裂素以及细胞分裂素合成抑制剂处理sic1植株，发现外源细胞分裂素处理 sic1植株能有效增加 sic1植株的茎生分枝数目，而细胞分裂素合成抑制剂处理则可以抑制 sic1植株茎生分枝的向外生长，但是这两种处理对于 sic1植株莲座叶分枝没有太大影响。表明相对于莲座叶分枝，sic1植株中茎生分枝对于细胞分裂素的含量更加敏感。
　　4).嫁接实验证实 sic1植株砧木可以互补独脚金内酯合成缺陷突变体接穗的表型，这个结果说明 sic1植株可以合成独脚金内酯。同时 WT型砧木不能影响sic1植株接穗的表型，且sic1植株砧木也不能影响WT型接穗的表型，这说明造成sic1植株分枝增多的因素不能通过长距离运输影响地上部分表型。
　　5)．独脚金内酯处理实验中GR24处理的sic1植株莲座叶分枝数目明显减少，证实sic1植株可以感知独脚金内酯处理，独脚金内酯信号传导途径没有缺陷。
　　6).基因芯片结果中，sic1植株叶腋部位大部分生长素响应基因表达量下调，表明这有可能是由sic1植株叶腋部位生长素含量下降引起的；独脚金内酯合成基因表达量下调，独脚金内酯信号传导基因表达量上调，表明有可能sic1植株叶腋部位由于其他因素影响引起了独脚金内酯含量的变化；细胞分裂素合成和激活基因表达量下调，细胞分裂素代谢和失活基因表达量上调，表明sic1植株叶腋部位处正在使细胞分裂素含量减少；核糖体相关基因表达量大部分都有所上调，表明sic1植株叶腋部位核糖体装配有可能要比野生型活跃。
　　综上所述，AtTRNl通过介导多种蛋白的入核转运，参与多个细胞信号转导途径，共同调控了植物生长发育的各个阶段，在植株形态建成方面，发挥了重要的作用。本论文结果有助于阐明植物细胞中TRN1的功能，为全面了解植物核质转运及分枝发育提供理论基础。

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第一章 前 言

1.1真核细胞中的核质转运简介

1.2 核定位信号（NLS）

1.3 核质转运受体蛋白

1.4 植物分枝生长调控研究现状

1.5 本论文的研究目的及意义

第二章 实验材料和方法

2.1实验材料

2.2实验方法

第三章 实验结果

3.1酵母双杂文库的筛选及蛋白互作的验证

3.2 Kapβ2和Kapl04p蛋白的底物在拟南芥中同源蛋白与AtTRN1的互作

3.3含有PY‐NLS基序的蛋白与AtTRN1的互作

3.4筛选蛋白与AtTRN1互作区域的确定

3.5 29个AtTRN1可能底物蛋白的GO（Gene Ontology）功能分类

3.6 AtTRN1表达量下降突变体sic1激活了分枝的向外生长

3.7生长素可抑制sic1部分分枝的向外生长

3.8 对sic1添加外源细胞分裂素能增加分枝的向外生长，添加细胞分裂素合成抑制剂能抑制分枝的向外生长

3.9 嫁接实验证实sic1可以合成独脚金内酯

3.10 外源施加以及内源缺失独脚金内酯对于sic1植株分枝数目的影响

3.11 sic1与分枝相关转录因子双突变体的表型分析

3.12 sic1与WT叶腋部位mRNA表达谱分析

3.13 叶腋部位转录组芯片的GO(Gene Ontology)以及KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)分析

3.14 通过转录组芯片进一步分析sic1植株中分枝增多的可能原因

第四章 讨论

4.1本论文中互作蛋白筛选方法的优点和缺点

4.2 AtTRN1可能底物的GO（Gene Ontology）功能分类

4.3 AtTRN1识别的蛋白结构域

4.4 核质转运载体AtTRN1表达量下降影响了植株分枝的数目

4.5 sic1植株分枝增多受多种因素调控

第五章 结论与展望

5.1 通过三种方法筛选到29个拟南芥核质转运蛋白AtTRN1可能的底物

5.2 AtTRN1可以识别含有PY‐NLS基序的片段

5.3 AtTRN1表达量下降突变体sic1具有多分枝表型，并且受生长素和细胞分裂素调控

5.4 sic1植株能合成独脚金内酯，并且sic1植株分枝受独脚金内酯调控

5.5 sic1植株多分枝表型能被brc1‐2植株多分枝表型掩盖

5.6 转录组芯片证实sic1植株分枝增多受多个信号途径调控

参考文献

附

录

研究成果

致谢