Sigma-1受体和proNGF在IL-6诱导的乳鼠心肌细胞损伤中变化的研究

摘要

目的：探讨Sigma-1受体和proNGF等在IL-6或缺氧复氧诱导乳鼠心肌损伤下的变化及与凋亡的关系。 方法：1．建立IL-6诱导的乳鼠心肌细胞损伤模型。具体方法为：分离SPF级新生SD大鼠乳鼠心肌细胞，培养48h后行细胞计数并随机分为正常组（Nor组）、IL-6（400μg/L）组、IL-6（800μg/L）组、IL-6（1200μg/L）组。其中Nor组于37?C培养箱中常氧持续培养24h，余各组加入上述不同浓度IL-6后按Nor组培养24h，于24h末利用流式细胞仪测定各组乳鼠心肌细胞凋亡率，以凋亡率达50%左右组别的浓度作为后续实验IL-6诱导细胞损伤干预浓度。2. 分离SPF级新生SD大鼠乳鼠心肌细胞，培养48h后行细胞计数并随机分为正常组（Nor组）、IL-6组、缺氧/复氧组（H/R组）、IL-6+H/R组，其中Nor组37℃培养箱中持续培养24h；IL-6组在培养基中加入浓度为800μg/L的IL-6后培养同Nor组； H/R组先缺氧8h，再复氧16h处理；IL-6+H/R组则在培养基中加入IL-6后余处理同H/R组。各组于24h末通过流式细胞仪测定乳鼠心肌细胞凋亡率，通过Real-time-PCR检测proNGF、p75NTR、sortilin及Sigma-1受体的表达，并用western blot检测proNGF蛋白的表达。 结果： 1. 各组诱发乳鼠心肌细胞凋亡情况：与Nor组相比，IL-6组、H/R组、IL-6+H/R组心肌细胞凋亡率均明显上升（P＜0.05），其中IL-6+H/R组凋亡率较IL-6组及H/R组升高明显（P＜0.05），而IL-6组凋亡率高于H/R组（P＜0.05）。 2. IL-6和H/R处理后乳鼠心肌细胞proNGF、p75NTR、sortilin及Sigma-1受体mRNA水平的改变：IL-6组、H/R组、IL-6+H/R组与Nor组相比， proNGF、p75NTR 、sortilin、Sigma-1受体mRNA表达增多（P<0.05），同时结果显示，IL-6组proNGF、p75NTR、 Sigma-1受体mRNA表达较IL-6+H/R组低但高于H/R组（P<0.05），而sortilin mRNA在IL-6组、H/R组、IL-6+H/R各组间差异均无意义（P>0.05）。 3. IL-6和H/R处理后乳鼠心肌细胞proNGF蛋白的表达量变化：H/R组心肌细胞proNGF蛋白表达量较Nor组、IL-6组及IL-6＋H/R组高，差异有统计学意义（P＜0.05）；Nor组与IL-6组、IL-6＋H/R组之间差异无统计学意义（P>0.05）。 结论： 1. IL-6或H/R可上调proNGF、p75NTR、sortilin及sigma-1受体mRNA基因的表达，且H/R可上调proNGF 蛋白的表达，但IL-6无此效应； 2. IL-6或H/R均可诱导乳鼠心肌细胞凋亡，其机制可能与sigma-1受体、p75NTR及sortilin mRNA基因表达上调有关； 3. proNGF参与H/R诱导的乳鼠心肌细胞凋亡，而IL-6诱导的乳鼠心肌细胞凋亡与此可能无关； 4. IL-6、H/R诱导乳鼠心肌细胞凋亡二者具有加和效应。

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损伤中变化的研究

Abstract

2.2 缺氧／复氧损伤模型的制备

参照Tian-Qi Tao的方法

2.3 IL-6诱导的乳鼠心肌细胞凋亡损伤浓度实验

2.4实验分组及处理如下

2.5 流式细胞仪检测乳鼠心肌细胞凋亡?

2.6 Real-time-PCR检测乳鼠心肌细胞，proNGF、p75NTR、sortilin及S

2.7 western blot检测乳鼠心肌细胞proNGF蛋白的表达

一、制备SDS-PAGE 凝胶

二、样品变性及电泳

三、 凝胶转膜及其检测

4结果

4.1 SD大鼠乳鼠原代心肌细胞分离培养结果

4.2流式细胞仪检测乳鼠心肌细胞凋亡

4.2.1 不同IL-6浓度诱发乳鼠心肌细胞凋亡情况

4.2.2 各组诱导乳鼠心肌细胞凋亡情况

与Nor组相比，IL-6组、H/R组、IL-6+H/R组心肌细胞凋亡率均明显上升（P(0.0

Tab 2 Changes of cardiomyocyte apoptosis rate in d

Fig.10 Amplification curve of sigma-1receptor mRNA

Fig.15 Melting curve of sigma-1receptor mRNA

4.4 western blot检测乳鼠心肌细胞proNGF蛋白的表达

1 sigma-1受体的生物学特征

Hanner等人最初纯化和克隆了豚鼠的 sigma-1受体[10]，同时他发现sigma-1受

2 sigma-1受体在心脏中的作用

研究表明，心脏中超过95％的结合位点是 sigma-1受体亚型[22]。Sigma受体基于自身

2.1 sigma-1受体抗心律失常的作用

一些sigma受体配体具有致心律失常作用，而另一些则具有抗心律失常作用[24]。在大鼠和豚鼠L

2.2 sigma-1受体抗心肌肥大的作用

sigma-1受体的激动剂 DHEA 在作用于心肌肥大的大鼠中实验中 [28-30]， 观察

最新研究表明miR-297被认为是sigma-1受体的潜在靶miRNA。横向主动脉结扎诱导的肥

2.3 sigma-1受体抗心力衰竭的作用

有研究人员发现心衰时或后，心脏 sigma-1 受体表达下降[33],且下降程度与心功能受损

3.1 sigma-1 受体调节细胞内Ca2+

sigma-1调控细胞内Ca2+浓度作用备受瞩目。众所周知，缺血缺氧时因细胞Na+-Ca2+

3.2 sigma受体调节心肌细胞中的电压门控离子通道

激活sigma-1受体的重要生物学活性是抑制离子通道，其通过蛋白质-蛋白质相互作用而不受G蛋

3.3 sigma-1 受体抗氧化应激反应