胡杨DWF4(PeDWF4)异源表达对新疆杨生长发育、愈伤组织诱导和耐盐性的影响

摘要

油菜素类固醇（BRs）是上世纪70年代在植物中发现的类固醇激素。研究发现，BR参与调控植物生长发育的各个方面，包括细胞伸长及分裂、光形态建成、叶和根的发育、植物育性、果实成熟、种子休眠和萌发、维管组织分化、衰老及生物和非生物胁迫适应等。DWF4是BR合成的关键酶基因，该酶催化的反应是BR生物合成的限速步骤。为了探讨BR调节植物非生物胁迫适应的分子机制，以及通过转基因手段促进植物生长发育和提高植物抗逆境胁迫能力的可能性，本研究1）将胡杨DWF4基因（PeDWF4）转入新疆杨基因组中，建立了PeDWF4-新疆杨转基因系，分析了它们的表型变化；2）以PeDWF4-新疆杨转基因系、新疆杨野生型（WT）和胡杨叶片为外植体诱导产生愈伤组织，比较了三者对外源激素的反应；3）分析了三种愈伤组织的耐盐（NaCl）性及在盐胁迫条件下BR生物合成酶基因DWF4、BR信号转导基因BZR1、Na+/H+转运蛋白基因NHX1和Ca2+结合蛋白基因CBL10的表达水平变化。主要结果如下：
　　1）以新疆杨无菌苗叶片为受体，通过农杆菌介导法将PeDWF4导入新疆杨基因组中，经Hyg筛选及PCR鉴定，共获得4个PeDWF4-新疆杨转基因系（分别命名为TL3、TL4、TL6、TL10）。移栽到土壤后，对转基因系的表型分析发现，相较于WT，转基因植株叶面积增加、叶夹角减小、茎直径增加、节间生长加快，但主根和侧根减少，且主根变短，其中TL6的表型最明显；
　　2）将新疆杨转基因系TL6、新疆杨野生型（WT）和胡杨无菌苗或实生苗叶片接种到分别含2,4-D（TL6和WT）或6-BA+NAA（胡杨）的MS培养基上诱导产生出了愈伤组织，这三种愈伤组织质地和颜色相似，但与WT相比，TL6系愈伤组织形成时间缩短，生长速率加快；
　　3）将三种愈伤组织分别接种至含有0、50、100和150 mmol/L NaCl的培养基上，与对照（0 mmol/L）相比，在50、100、150 mmol/L盐胁迫下，胡杨/WT/TL6愈伤组织的生长速率降幅大小分别为1.7％/81.5%/45.6%、16.4%/91.1%/59.9%和58.2%/93.7%/85.2%。表明TL6耐盐胁迫的能力大于WT但又小于胡杨；
　　4）RT-PCR分析结果表明，在相同（100 mmol/L NaCl）盐胁迫条件下，与对照相比（0 mmol/L NaCl），胡杨、WT和TL6愈伤组织中的DWF4和NHX1的表达均上调。BZR1表达均出现下调，但上调或下调幅度的大小不同：胡杨>TL6>WT；此外，胡杨和TL6愈伤组织中CBL10的表达上调，WT愈伤组织中CBL10则表达下调，胡杨愈伤组织中CBL10上调幅度大于TL6。
　　以上结果说明，PeDWF4的异源表达可以通过调节BR的生物合成进而促进植物的生长发育并能提高植物抗盐胁迫的能力，这在林木或作物性状改良方面具有潜在的重大应用价值。

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第一章 前言

1.1 油菜素类固醇（BRs）是植物激素

1.2 BRs与植物生长发育调控

1.3 BRs与植物抗逆性

1.4 BRs的合成与代谢

1.5 BRs信号转导

1.6 DWF4

1.7 研究的目的和意义

第二章 材料与方法

2.1 材料

2.2 实验方法

第三章 实验结果

3.1 新疆杨再生体系的建立

3.2 Hyg抗性芽筛选浓度的确定

3.3 Hyg抗性植株的获得

3.4 Hyg抗性植株目的基因PCR检测

3.5 PeDWF4转基因植株的移栽

3.6 转基因植株转录水平鉴定

3.7 PeDWF4-新疆杨转基因系表型分析

3.8 胡杨、新疆杨WT和转基因系TL6愈伤组织培养

3.9 NaCl处理对三种愈伤生长的影响

3.10 NaCl处理下DWF4表达分析

3.11 NaCl处理下其他相关基因的表达分析

第四章 讨论

4.1 PeDWF4-新疆杨转基因系的获得

4.2 PeDWF4可促进新疆杨生长发育和愈伤组织生长分化

4.3 PeDWF4可增强新疆杨愈伤组织耐盐性

4.4 DWF4参与调控胡杨和新疆杨抗盐胁迫的机制

参考文献

致谢