羟氯喹抑制自噬活性逆转白血病K562/ADM细胞耐药性

摘要

背景：自噬是存在于真核细胞的依赖溶酶体降解来清除衰老及损伤细胞器和生物大分子物质，进而实现再利用的生物学过程。自噬与肿瘤的关系非常密切，肿瘤的发生发展过程中自噬活性具有两面性：一方面机体可利用自噬作用杀伤或清除肿瘤细胞，另一方面肿瘤细胞也可依赖自噬作用获取相对较好的生存环境。当肿瘤细胞遭受抗癌药物和辐射等压力刺激时，肿瘤细胞可通过自噬来对抗药物和射线的细胞毒性，增强肿瘤细胞的耐受性。有关自噬活性与肿瘤细胞耐药性的关系研究有望通过调控自噬活性来干预肿瘤耐药性问题。
　　目的：本课题拟通过比较研究白血病敏感细胞和耐药性细胞的基础性及诱发性自噬活性的差异，探讨能否通过采用自噬抑制剂羟氯喹抑制细胞自噬活性来克服白血病细胞的药物耐受性，并探讨自噬与白血病细胞耐药性的相关性。
　　方法：以白血病药物敏感K562细胞和耐药K562/ADM细胞为模型，检测细胞基础自噬活性，营养剥夺（饥饿）和阿霉素（ADM）处理诱导细胞自噬；羟氯喹预处理后检测细胞对ADM的敏感性。采用透射电镜和单丹磺酰尸胺（MDC）荧光染色观察细胞自噬形态学；采用吖啶橙（AO）/溴乙锭（EB）双染观察细胞凋亡形态学；MTT法检测细胞增殖活性；实时荧光定量RT-PCR法检测beclin1、bax、bcl-2和mdr1基因mRNA的相对表达量；流式细胞术检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2和耐药蛋白P-gp的表达以及Caspase-3活性；Western blot检测LC3I/II、Beclin1、Bax、Bcl-2、Caspase-3、P-gp的表达以及P62的水平。
　　结果：K562/ADM细胞对阿霉素具有很高的耐受性，12h、24h、48h的半数抑制浓度（IC50）值分别是K562细胞的20.6倍，44.7倍和62.9倍；流式细胞术和Western blot检测结果显示K562细胞中极少表达耐药蛋白P-gp，而K562/ADM细胞几乎100％表达高水平的P-gp。K562/ADM细胞的基础水平自噬活性高于K562细胞，表现在与K562细胞比较，K562/ADM细胞浆内出现明显的包裹有内容物的自噬泡结构，MDC染色后荧光显微镜观察显示K562/ADM细胞内的自噬体荧光明显强于K562细胞，K562/ADM细胞Beclin1的表达和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值也明显较K562细胞增高，而P62蛋白的含量则低于K562细胞。K562细胞和K562/ADM细胞培养在不含血清及氨基酸的EBSS平衡缓冲液中0h、1h、2h、4h、6h，或经不同浓度的阿霉素诱导12h和24h后，细胞内不同程度地出现多量典型的自噬泡结构，Beclin1表达水平和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均在饥饿培养1h时达到峰值后缓慢下降，而P62蛋白的降解则在饥饿2-4h才达到峰值。阿霉素同样能诱导增强K562细胞和K562/ADM细胞的自噬活性，但K562细胞的自噬变化出现较早，且阿霉素诱导的自噬活性可被自噬抑制剂羟氯喹所抑制。为证实自噬活性与细胞对化疗药物耐受性的关系和应用自噬抑制剂克服白血病细胞耐药性的可能性，我们采用不同浓度的羟氯喹抑制K562细胞和K562/ADM细胞的自噬活性后，检测了细胞对化疗药物阿霉素的敏感性。结果发现K562细胞对阿霉素的敏感性增强，12h、24h和48h的IC50值分别是阿霉素单独作用的0.98倍、0.84倍、0.42倍，而K562/ADM细胞对阿霉素的敏感性则显著增强，IC50值分别为0.84倍、0.46倍、0.21倍。同时，K562/ADM细胞中出现更加典型的凋亡形态学改变，Bax/Bcl-2比值和Caspase-3的表达也显著增高。更为有趣的是当饥饿诱导发生自噬时K562/ADM细胞mdr1基因mRNA和P-gp的表达明显增高，而羟氯喹抑制自噬活性则显著降低P-gp的表达水平。
　　结论：K562/ADM耐药细胞较其亲本敏感K562细胞具有更高的基础自噬活性，营养剥夺和细胞毒药物可诱发其自噬活性增高，自噬抑制剂羟氯喹通过抑制自噬活性和促进细胞凋亡而显著增强 K562/ADM耐药细胞对阿霉素的敏感性。此外，增强K562/ADM耐药细胞自噬活性促进P-gp表达，而抑制自噬活性则显著减低P-gp的表达，提示P-gp有可能通过参与调控耐药细胞自噬活性的途径而维持细胞的耐药性。

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第一章 细胞的自噬活性与白血病耐药

1细胞自噬概述

1.1 细胞自噬的类型与功能

1.2 细胞自噬的过程

1.3 细胞自噬的调控机制

2 细胞自噬与造血干细胞功能

3自噬与白血病的关系

3.1 自噬与急性髓性白血病（AML）

3.2 自噬与急性早幼粒细胞白血病（APL）

3.3 自噬与急性B淋巴细胞白血病（B-ALL）

3.4 自噬与急性T淋巴细胞白血病（T-ALL）

3.5 自噬与慢性髓系白血病（CML）

4 细胞自噬与细胞凋亡

4.1调控细胞凋亡与自噬的分子

4.2 肿瘤治疗中的自噬与凋亡的关系

5 细胞自噬与白血病耐药性

5.1白血病多药耐药性

5.2 自噬在MDR中的作用

参考文献

第二章 羟氯喹抑制自噬活性逆转白血病K562/ADM细胞耐药性

前言

材料与方法

1 仪器与试剂

2 实验方法

结果

1 K562/ADM细胞与K562细胞对阿霉素的敏感性

2 K562/ADM耐药细胞与其亲本K562细胞的自噬活性

3 阿霉素增强K562/ADM和K562细胞的自噬活性

4 羟氯喹抑制自噬活性增强K562/ADM细胞对药物的敏感性

5 羟氯喹抑制自噬活性对P-糖蛋白表达的影响

讨论

参考文献

结论

缩略词表

在学期间研究成果

致谢