红砂响应盐和渗透胁迫的泌盐机制研究

摘要

盐腺是泌盐植物特有的一种结构，盐渍生境中，植物可以通过叶片或者茎部的盐腺将体内的盐分外排至外界环境中，维持植株正常的生理过程。因此，盐腺泌盐对植物适应逆境有重要意义。泌盐型超旱生植物红砂(Reaumuria soongorica)在盐渍生境中可以通过盐腺泌盐维持体内较低的Na+水平，避免Na+毒害，提高植株的抗逆性，但目前对盐腺的泌盐机制还不清楚。高等植物质膜和液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白分别介导细胞Na+外排以及Na+在液泡中的区域化，从而减轻过量Na+对细胞质的毒害。然而，上述蛋白是否参与了泌盐植物盐腺的泌盐过程还未可知。鉴于此，本研究以红砂为实验材料，采用非损伤微测技术(NMT)分析盐或渗透胁迫处理下红砂盐腺的实时泌盐动态，在此基础上通过RT-PCR方法克隆红砂质膜和液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白编码基因，并用实时定量PCR的方法分析上述基因在红砂响应盐和渗透胁迫过程中的表达模式，主要结果如下：
　　(1)红砂叶片表皮细胞间有很多细胞质浓稠的盐腺，深陷于表皮细胞间。红砂具有很强的耐盐性，其盐腺可以将大量的Na+分泌出来，缓解Na+毒害，提高其渗透调节能力，从而维持植株在高盐下的正常生长。
　　(2)盐和渗透胁迫下均能显著诱导红砂盐腺 Na+外排和 H+内流，而H+-ATPase抑制剂正钒酸钠处理可显著降低盐腺Na+外排及H+内流速率，证实红砂泌盐过程存在主动的Na+和H+交换。
　　(3) RsSOS1编码1144个氨基酸，与已报道的其它植物SOS1具有较高的同源性(64％以上)，具有环核苷酸、Crp以及b cap1等保守结构域，属于Na+/H+转运蛋白家族。与RsSOS1主要在地上部表达，受盐胁迫(50和200 mmol·L-1 NaCl)和渗透胁迫(-0.5和-1.0 MPa)处理的显著诱导。说明RsSOS1可能参与红砂盐腺分泌细胞对 Na+的外排过程，在盐渍环境中，其表达丰度快速上调，促进盐腺对Na+的分泌。
　　(4) RsNHX1部分片段编码312个氨基酸，与其它植物 NHX1的同源性在77%以上。RsNHX1主要地上部表达，受盐胁迫(50和200 mmol·L-1 NaCl)和渗透胁迫(-0.5和-1.0 MPa)处理的显著诱导。推测RsNHX1可能介导红砂盐腺收集细胞Na+向液泡中的区域化，在盐渍环境中，其表达丰度快速上调，促进Na+向盐腺的积累。
　　综上所述，红砂具有很强的抗逆性，其盐腺泌盐过程存在主动的Na+、H+交换。RsSOS1和RsNHX1在红砂响应盐和渗透胁迫的泌盐过程中起着重要作用。

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第一章 引言

第二章 国内外研究进展

2.1 盐生植物及其抗逆机理

2.1.1 盐生植物类型

2.1.2 盐生植物的耐盐机理

2.1.3 盐生植物的抗旱机理

2.2 植物中的Na+转运机制

2.2.1 SOS1在植物Na+外排中的作用

2.2.2 NHX1在植物Na+区域化中的作用

2.3 泌盐植物的泌盐机理

2.3.1 泌盐结构特征及泌盐机理

2.3.2 泌盐植物红砂的抗性研究

第三章 盐胁迫和渗透胁迫下红砂泌盐动态研究

3.1 材料与方法

3.1.1 材料培养及处理

3.1.2 主要仪器

3.1.3 红砂叶片盐腺的电镜观察

3.1.4 鲜重、干重和组织含水量的测定

3.1.5 植株组织Na+和K+含量的测定

3.1.6 盐腺分泌Na+和K+量的测定

3.1.7 不同处理下红砂盐腺表面离子流速的测定

3.1.8 数据分析

3.2 结果与分析

3.2.1 红砂叶片盐腺的电镜观察

3.2.2 不同浓度NaCl处理下红砂的生物量和组织含水量

3.2.3 不同浓度NaCl处理对红砂体内Na+和K+含量的影响

3.2.4 不同浓度NaCl处理对红砂地上部分泌Na+和K+含量的影响

3.2.5 NaCl处理下红砂盐腺表面的离子流速

3.2.6 渗透胁迫下红砂盐腺表面的离子流速

3.2.7 H+-ATPase抑制剂正钒酸钠对红砂盐腺的离子流速的影响

3.3 讨论

3.3.1 红砂盐腺的结构

3.3.2 红砂具有很强的耐盐性

3.3.3 红砂响应NaCl和渗透胁迫处理的泌盐特征

3.4 小结

第四章 Na+/H+逆向转运蛋白在红砂盐腺泌盐的作用研究

4.1 材料与方法

4.1.1 材料培养及处理

4.1.2 主要试剂及配方

4.1.3 主要仪器

4.1.4 红砂总RNA的提取

4.1.5 红砂RsSOS1基因核心片段的克隆

4.1.6 红砂RsSOS1基因5’端的克隆(5’-RACE)

4.1.7 红砂RsSOS1基因3’端的克隆(3’-RACE)

4.1.8 红砂RsNHX1基因核心片段的克隆

4.1.9 红砂RsNHX1基因3’端的克隆(3’-RACE)

4.1.10 红砂RsSOS1、RsNHX1和RsP-ATPase的组织特异性及其在地上部表达模式分析

4.1.11 数据分析

4.2 结果与分析

4.2.1 红砂地上部总RNA的质量检测

4.2.2 红砂RsSOS1核心片段的克隆

4.2.3 红砂RsSOS1基因5’端的克隆

4.2.4 红砂RsSOS1基因3’端的克隆

4.2.5 红砂RsSOS1基因的生物信息学分析

4.2.6 红砂RsNHX1核心片段的克隆

4.2.7 红砂RsNHX1基因3’端的克隆

4.2.8 红砂RsNHX1基因部分片段的生物信息学分析

4.2.9 NaCl处理下红砂RsSOS1、RsNHX1和RsP-ATPase的组织特异性表达

4.2.10 不同浓度NaCl和不同渗透势处理对红砂RsSOS1在地上部表达的影响

4.2.11 不同浓度NaCl和不同渗透势处理对红砂RsNHX1在地上部表达的影响

4.3 讨论

4.3.1 RsSOS1的结构特性及介导红砂盐腺泌Na+

4.3.2 RsNHX1的结构特性及表达模式分析

4.4 小结

第五章 结论

参考文献

在学期间的研究成果

致谢