GF、SPF、CL级BALB/c小鼠肠道、脾脏CD4+CD25+Foxp3+Treg TCRβCDR3组库异质性分析

摘要

目的： 通过对同月龄无菌(Germ free, GF)级、无特定病原体（Specific pathogen free, SPF）级、清洁(Clean,CL)级BALB/c小鼠，局部组织（肠道）和外周免疫器官（脾脏）中调节性T细胞(Regulatory cells,Treg)TCRβ链CDR3组库的组成和特征性分析，初步探究肠道共生微生物的差异性组成对BALB/c小鼠CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞耐受性和应答功能的影响，为GF、SPF、CL级BALB/c小鼠中Treg细胞的机制及应用研究提供新的思路、监测技术和可供参考的基础数据。 方法： 1. 从第三军医大学基础部实验动物学教研室，购买4月龄GF级、SPF级CL级BALB/c小鼠各3只。9只BALB/c小鼠的研究样本命名为： GF1-SP（GF级1号脾脏组织），GF1-In（GF级1号肠道组织） GF2-SP（GF级2号脾脏组织）, GF2-In（GF级2号肠道组织） GF3-SP（GF级3号脾脏组织），GF3-In（GF级3号肠道组织） SPF1-SP（SPF级1号脾脏组织），SPF1-In（SPF级1号肠道组织）, SPF2-SP（SPF级2号脾脏组织），SPF2-In（SPF级2号肠道组织） SPF3-SP（SPF级3号脾脏组织），SPF3-In（SPF级3号肠道组织） CL1-SP（CL级1号脾脏组织），CL1-In（CL级1号肠道组织） CL2-SP（CL级2号脾脏组织），CL2-In（CL级2号肠道组织） CL3-SP（CL级3号脾脏组织），CL3-In（CL级3号肠道组织） 2.分别采集9只BALB/c小鼠的脾脏和肠道组织，采用美天旎Treg磁珠分选试剂盒分选出脾脏和肠道中CD4+CD25+Treg细胞。 3. 经流式分析技术鉴定所分选出的每个样本中CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞含量达80%左右，并提取所有样本基因组DNA。 4. 采集各级别共9只BALB/c小鼠粪便样本，送华大基因公司完成粪便微生物基因 组的测序。 5. 经美国 Adaptive Biotechnologies ImmunoSEQ 公司鉴定，各送检样本基因组DNA浓度和纯度符合建库及测序要求后，对9只不同级别BALB/c小鼠的脾脏和肠道组织中CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞TCRβ链CDR3组库进行构建并且完成Illumina Solexa 高通量测序。 6. 对9只BLAB/c小鼠脾脏和肠道组织中Treg细胞TCRβ链CDR3组库的组成和特征进行分析，测序后对获得的原始数据经以下原则分类筛选：(1)Total CDR3序列;(2)Total In-frame CDR3序列；(3)Unique CDR3序列；(4)Unique In-frame CDR3序列；(5)Productive序列。最后每个样本以Productive序列作为基础进行分析，从而获得每个样本中Treg细胞TCRβ链CDR3组库的CDR3克隆水平、TRBV、TRBJ基因取用和配对情况，以及CDR3氨基酸构成等，最后利用Graphpad软件、HemI软件和Draw Venn Diagram在线软件进行进一步的分析及统计。 7. 将3种不同级别BALB/c小鼠共9个粪便样本送华大基因公司做粪便微生物基因组测序，通过PCR扩增完成质检后将PCR扩增后的序列拼接成Tags，随后将处理过的Clean Tags进行OTU聚类，然后通过对OTU注释完成OTU的物种分类，最后运用相关软件分析粪便中微生物物种的多样性和丰度值。 8. 将华大基因公司所提供的粪便测序结果，同美国SEQ 公司Illumina Solexa 高通量测序结果进行对比分析。 结果： 1．实验共获得17个样本肠道和脾脏Treg TCRβ链CDR3组库功能性独特序列/功能性总序列数目分别为： GF1-In：100/129 GF1-SP：18452/25891 GF2-In：47/59 GF2-SP：2616/3880 GF3-In：100/123 GF3-SP：19131/26071 SPF1-In：59/77 SPF1-SP:19798/27897 SPF2-In：29/36 SPF2-SP:41709/60573 SPF3-In：576/1116 SPF3-SP：（组库构建未成功） CL1-In：133/172 CL1-SP：12021/16528 CL2-In：63/80 CL2-SP：19390/26116 CL3-In：17/20 CL3-SP：19368/25864. 2. 17个样本肠道和脾脏Treg TCRβ链CDR3组库TRBV-TRBJ基因优势配对： （1）9个肠道样本中Treg TCRβ链CDR3组库TRBV、TRBJ基因家族优势配对： GF 组 3 只 BALB/c 小 鼠 高 频 取 用 （ >3% ） 为 TRBV19-01-TRBJ02-07 ；TRBV20-01-TRBJ02-07；TRBV13-02-TRBJ02-01。 SPF 组 3 只 BALB/c 小 鼠 高 频 取 用 （ >3% ） 为 TRBV19-01-TRBJ02-07；TRBV13-01-TRBJ02-01。 CL组3只BALB/c小鼠高频取用（>3%）为TRBV19-01-TRBJ02-07。 （2）8个脾脏样本中Treg TCRβ链CDR3组库TRBV-TRBJ基因优势配对： GF 组 3 只 BALB/c 小 鼠 高 频 取 用 （ >2% ） 为 TRBV13-02-TRBJ02-07 ， TRBV05-01-TRBJ02-07 ， TRBV13-01-TRBJ02-07 ， TRBV19-01-TRBJ02-07 ， TRBV31-01-TRBJ02-07。 SPF 组 2 只 BALB/c 小 鼠 高 频 取 用 （ >2% ） 为 TRBV05-01-TRBJ02-07 ， TRBV01-01-TRBJ02-07，TRBV02-01-TRBJ02-07，TRBV04-01-TRBJ02-07。 CL 组 3 只 BALB/c 小 鼠 高 频 取 用 （ >2% ） 为 TRBV05-01-TRBJ02-07 ， TRBV19-01-TRBJ02-07，TRBV01-01-TRBJ02-07，TRBV02-01-TRBJ02-07。 3. 17个样本肠道和脾脏Treg TCRβ链CDR3组库TRBV、TRBJ基因家族中高频取用：（1）TRBJ基因家族在BALB/c小鼠肠道Treg TCRβ链CDR3组库中前2个优势取用基因： GF组前2个优势取用为TRBJ02-07和TRBJ02-01； SPF组前2个优势取用为TRBJ02-07和TRBJ01-04； CL组前2个优势取用为TRBJ02-07和TRBJ01-04。 （2）TRBJ基因家族在BALB/c小鼠脾脏Treg TCRβ链CDR3组库中前2个优势取用基因： GF组前2个优势取用为TRBJ02-07和TRBJ01-04； SPF组前2个优势取用为TRBJ02-07和TRBJ01-04； CL组前3个优势取用为：TRBJ02-07和TRBJ01-04。 （3）TRBV基因家族在BALB/c小鼠肠道中前2个优势取用基因： GF组前2个优势取用为TRBV19-01和TRBV13-02； SPF组前2个优势取用为TRBV19-01和TRBV05-01； CL组前2个优势取用为TRBV19-01和TRBV05-01。 （4）TRBV基因家族在BALB/c小鼠脾脏中前2个优势取用基因： GF组前2个优势取用为TRBV19-01、TRBV05-01； SPF组前2个优势取用为TRBV19-01、TRBV05-01； CL组前2个优势取用为TRBV19-01、TRBV05-01。 4. 17个样本肠道和脾脏Treg TCRβCDR3 AA取用和长度分布： （1）17个实验样本中Treg TCRβCDR3 AA取用前2种高频氨基酸均为丝氨酸（S）和甘氨酸（G），其中均以丝氨酸（S）取用为主。 （2）CL级和GF级BALB/c小鼠12个样本中，Treg TCRβCDR3 AA长度均是以12个氨基酸长度为主的钟型分布。SPF级BALB/c小鼠5个样本中除SPF1-In、SPF1-SP样本是以13个氨基酸长度为主的钟型分布，其余SPF2-In、SPF2-SP、SPF3-In也均是以12个氨基酸长度为主的钟型分布。 5. 17个样本肠道和脾脏Treg TCRβCDR3核苷酸的插入与剪切： 17个实验样本中Treg TCRβCDR3核苷酸的插入与剪切均未见明显差异性表达。 6. 17个样本肠道和脾脏Treg TCRβCDR3的克隆扩增情况： （1）17个实验样本反辛普森指数（1/DS）分别为： GF1-In：229 GF1-SP：19670 GF2-In：131 GF2-SP：2359 GF3-In：277 GF3-SP：20622 SPF1-In：127 SPF1-SP：9120 SPF2-In：52 SPF2-SP：15141 SPF3-In：130 CL1-In：229.7 CL1-SP：19670 CL2-In：64 CL2-SP：18365 CL3-In：47 CL3-SP：13346 （2）17个样本克隆扩增前5条序列分析：仅1只BALB/c小鼠（SPF-1）脾脏和肠道中出现相同的CDR3氨基酸序列CASSDGGSGNTLYF。17个实验样本中均出现高度保守的氨基酸序列YEQY和NTLY。 （3）3种不同级别BALB/c小鼠脾脏Treg TCRβCDR3组库中大部分克隆增值均呈低频表现（<0.02%总TCR库）。CL级BALB/c小鼠脾脏中高频克隆（>0.08%总TCR库）最多，其次为SPF级，最少为GF级。 （4）3种不同级别BALB/c小鼠肠道Treg TCRβCDR3组库克隆增值程度中，SPF级、CL级克隆增值呈高频表现（>2%占总TCR库），GF级克隆增值程度呈中频表现（<2%占总TCR库）。 7. 17个样本肠道和脾脏Treg TCRβCDR3区独特的AA序列重叠情况： （1）GF级、SPF级、CL级同级别BALB/c小鼠肠道Treg TCRβCDR3中独特AA序列比较中未见重叠序列，而同级别GF级BALB/c小鼠脾脏Treg TCRβCDR3独特AA重叠序列为20条，同级别SPF级BALB/c小鼠脾脏Treg TCRβCDR3中独特AA重叠序列为1条，同级别CL级BALB/c小鼠脾脏Treg TCRβCDR3中独特AA重叠序列为178条。 （2）3组不同级别（GF1-In、SPF1-In、CL1-In；GF2-In、SPF2-In、CL2-In；GF3-In、SPF3-In、CL3-In）BALB/c小鼠肠道Treg TCRβCDR3中独特AA重叠序列为0条， 3组不同级别（GF1-SP、SPF1-SP、CL1-SP；GF2-SP、SPF2-SP、CL2-SP；GF3-SP、CL3-SP）BALB/c小鼠脾脏Treg TCRβCDR3中独特AA重叠序列

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