内源性大麻素在大鼠神经病理痛模型中镇痛作用与谷氨酸-谷氨酰胺循环关系研究

摘要

目的：观察内源性大麻素2-AG在大鼠保留性神经损伤（spared nerve injury)神经病理痛模型中镇痛效应，确定剂量效应关系，计算半数有效量，并阐述其镇痛效应的发生是否与抑制星形胶质细胞和神经元细胞之间谷氨酸-谷氨酰胺循环有关。
　　方法：成年雄性SD(Sprague Dawley)大鼠48只，体重180?220g，随机分为8组（n=6)，Normal组（空白组）：空白组不做任何处理；Sham组（假手术组)：分离暴露胫神经和腓总神经后，仅穿线不结扎；SNI模型组：通过分离暴露坐骨神经三个分支，结扎并切断其中的胫神经和腓总神经，保留腓肠神经完整来建立SNI模型，但不给予任何干预措施；N.S.组（生理盐水组）：建立SNI模型成功后，鞘内穿刺注射150生理盐水；2-AG干预1?4组：在建立SNI模型成功后，分别鞘内注射2-A G50nmol、100nmol、200nmol、400nmol。于手术前1日(BL。base line)，手术后1周（1week)及鞘内给药后15、30、45、60分钟测定大鼠机械爪缩阈值（Mechanical withdrawal threshold，MWT)。在最后一次行为学实验结束后，立即迅速处死大鼠并取脊髓标本，进行形态学及Western-Blot检测。采用免疫荧光双标记法观察Normal组大鼠、SNI模型组大鼠及SNI神经病理痛模型2-A G干预后，内源性大麻素受体C B1(cannabinoid receptor1)、CB2(cannabinoid receptor2)在脊髓表达情况及与神经元细胞、小胶质细胞、星形胶质细胞共表达情况;Normal组大鼠、SNI模型组大鼠及SNI模型组大鼠在2-AG干预后谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase，GS)的表达变化情况。Western-Blot实验检测大麻素受体CB1蛋白、CB2蛋白及GS蛋白表达量变化情况。
　　结果：行为学研究发现，Normal组与Sham组在术前及术后大鼠MWT均无统计学意义；与 Normal组相比，SNI模型组大鼠MWT明显下降（F(1,71)=3844.857。P<0.001)，在观察期的（1week及15、30、45、60分钟）时间点上也存在统计学意义（P<0.05); N.S.组与SNI模型组相比，大鼠MWT无统计学意义。鞘内注射不同剂量的内源性大麻素2-AG(50，100，200,400nmol；注射剂量15^l)后，观察到随着2-A G药物浓度的增加，对SNI诱导的大鼠神经病理性触诱发痛的抑制效应逐渐增强，且成剂量依赖关系。与 SNI模型组相比，2-AG400 nmol>200 nmol、100nmol、50nmol组大鼠MWT的上升均有统计学意义(2-AG400 nmol：F(1,71)=100.898。P<0.001；2-AG200 nmol：F(1,71)=15.207,P=0.011;2-A G100 n mol：F(1,71)=20.214。P=0.006;2-AG50 nmol：F(1,71)=36.554。P=0.002)。通过线性回归统计分析，得出2-A G在SNI神经病理性疼痛模型中，镇痛作用的半数有效量（ED5Q)值为227.25nmol。形态学研究显示，与Normal组相比，神经元细胞、星形胶质细胞以及小胶质细胞在SNI模型组均不同程度的被激活；在Normal组观察到，CB1受体在神经元、星形胶质细胞以及小胶质细胞均有表达，SNI组的CB1受体表达明显增强，且主要与星形胶质细胞共表达；2-AG干预后，神经元、星形胶质细胞以及小胶质细胞的表达减弱，同时CB1受体的表达亦减弱。在Normal组和SNI组均未观察到CB2受体的表达。在Normal组观察GS的表达，发现呈低表达；在SNI组，GS的表达明显增强，主要在星形胶质细胞上表达；2-AG干预后，明显的抑制了GS的表达和GS与星形胶质细胞的共表达。Western-blot检测显示，CB1受体在SNI组的表达明显高于Normal组，具有统计学差异（P<0.001)，2-A G的干预未能影响C B1受体的表达；C B2受体在Normal组未检测出表达，但在SNI组表达量明显提高(P<0.001)，且2-A G的干预后，CB2受体蛋白的表达有所下降(P<0.01);同Normal组比较，GS蛋白在SNI组表达明显提高(P<0.001);2-A G干预后，GS蛋白的表达明显下降（P<0.001)。
　　结论：内源性大麻素2-AG抑制了 SNI诱导的神经病理性触诱发痛，该镇痛效应的机制之一可能是通过内源性大麻素2-AG作用于星形胶质细胞上大麻素CB1受体，抑制了星形胶质细胞与神经元之间的谷氨酸-谷氨酰胺循环，从而减少了神经元突触末梢兴奋性神经递质谷氨酸的释放来实现的，但是不能排除可能通过CB2受体发挥镇痛效应，同时2-AG通过作用于神经元和小胶质细胞上的CB1受体产生镇痛效应亦不能排除。

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第一章引言

1 .1神经病理痛的产生、传导、主要临床表现及形成机制

1 .2内源性大麻素系统与神经病理性疼痛

1 .3星形胶质细胞在神经病理性疼痛中的作用

1 .4谷氨酸-谷氨酰胺循环在神经病理性疼痛中的作用

第二章材料与方法

2 .1实验动物

2.2 主要仪器设备

2.3 主要药品及试剂

2.4 模型建立

2.5 机械痛觉测定

2.6 鞘内注射给药

2.7 免疫荧光检测

2. 8 Western-blot检测

2. 9 实验分组

2.10统计学分析

第三章结果

3 .1行为学实验结果

3.2 免疫荧光实验结果

3. 3 Western-blot实验结果

第四章讨论

第五章创新点及局限性

5. 1本实验的创新点

5. 2本实验的局限性

第六章结论

参考文献

附录一

附录二

在学期间的研究成果

致谢