猫爪草醇类提取物对小鼠骨髓来源巨噬细胞极化的影响

摘要

目的： 巨噬细胞极化与感染、肿瘤等多种疾病的发生发展密切相关，现有研究显示巨噬细胞极化有望成为疾病治疗的重要干预靶点。中草药猫爪草具有抗瘤、抗结核及抗炎等功效，用于辅助治疗结核、肺癌、恶性淋巴瘤等疾病。研究发现，猫爪草可增强巨噬细胞吞噬功能，但其对巨噬细胞极化的影响作用尚未见明确报道。本课题拟用猫爪草醇类提取物刺激小鼠骨髓来源巨噬细胞，了解猫爪草对巨噬细胞极化的影响作用，探讨猫爪草醇类提取物中可影响巨噬细胞极化的主要成分，并初步研究其相关作用机制。为进一步开发猫爪草相关临床用药奠定研究基础，也可为后续深入探讨结核、肿瘤等疾病的中医治疗提供科学依据。 方法： 1. 猫爪草醇提取物对小鼠骨髓来源M0型巨噬细胞极化的影响 设置六组浓度梯度的 RTR 分别诱导小鼠骨髓来源 M0 型巨噬细胞，采用CCK8技术检测RTR对巨噬细胞活性影响，寻找RTR作用巨噬细胞的最佳浓度；以此浓度诱导M0型巨噬细胞，孵育0 h、12 h、24 h、36 h、48h、72 h，观察巨噬细胞的形态改变；Real-time PCR技术检测Arg-1、IL-10、TGF-β、iNOS、IL-6和TNF-α等细胞因子mRNA表达水平，ELISA技术检测不同时间点上清培养液中细胞因子(TNF-α、IL-10、TGF-β1)分泌水平变化，流式细胞术(FCM)检测F4/80、CD206、NOS2分子表达水平。 2. 猫爪草醇类提取物中影响巨噬细胞极化的主要成分筛选 高效液相等技术分离并鉴定RTR全成分，筛选出可能诱导巨噬细胞M1极化的单体成分。取其最适浓度分别诱导小鼠骨髓来源巨噬细胞 24h，Real-time PCR 技术检测 M1/M2 型相关巨噬细胞细胞因子 mRNA相对表达水平，筛选出与RTR刺激小鼠骨髓来源M0型巨噬细胞向M1型极化可能的单体化合物为棕榈酸(Palmitic Acid, PA)，小毛茛内酯(Ternatlide, Tern)。 3. PA/Tern对小鼠骨髓来源M0型巨噬细胞极化的影响 采用CCK8技术检测PA/Tern的巨噬细胞毒性，寻找其作用巨噬细胞的最佳浓度；以此浓度孵育24h，观察巨噬细胞的形态改变；Real-time PCR检测M1相关因子(iNOS、IL-6 和 TNF-α等)及 M2 相关细胞因子(Arg-1、IL-10、TGF-β等)mRNA表达水平，ELISA 检测不同时间点细胞培养液上清 TNF-α、IL-10、TGF-β1细胞因子分泌水平变化，FCM检测F4/80、CD206、NOS2分子表达水平。 4. PA/Tern分别在猫爪草诱导M0巨噬细胞极化过程中的作用 根据 PA/Tern 在猫爪草中的成分比例，分别以工作浓度诱导小鼠骨髓来源M0型巨噬细胞0-72h，Real-time PCR检测M1/M2巨噬细胞相关细胞因子mRNA表达水平，ELISA检测不同时间点细胞培养液上清TNF-α、IL-10、TGF-β1细胞因子分泌水平变化，流式细胞术检测F4/80、CD206、NOS2分子表达水平。5. PA与Tern在猫爪草诱导M0巨噬细胞极化过程中的相互作用 以PA/Tern工作浓度共同作用于小鼠骨髓来源M0型巨噬细胞，孵育0-72h， Real-time PCR检测M1相关细胞因子(iNOS、IL-6和TNF-α等)及M2相关细胞因子(Arg-1、IL-10、TGF-β)mRNA表达水平，ELISA检测不同时间点细胞培养液上清TNF-α、IL-10、TGF-β1细胞因子分泌水平变化，流式细胞术检测F4/80、CD206、NOS2分子表达水平。 6. RTR诱导小鼠骨髓来源巨噬细胞极化的可能机制 培养成熟的 M0 型巨噬细胞经 RTR、PA、Tern 分别刺激 24 h、48 h 后， Western blot技术检测M1/M2相关MAPK信号通路及NF-κB信号通路相关蛋白的表达水平。 结果： 1. RTR刺激小鼠骨髓来源M0型巨噬细胞24h后，CCK8检测发现RTR诱导巨噬细胞最佳浓度为100μg/mL；巨噬细胞镜下观：与圆形(或椭圆形)的M0型巨噬细胞向比，诱导后的巨噬细胞两端细长中部宽大，且部分细胞出现伪足，与M1型巨噬细胞形态较为一致；Real-time PCR结果显示：RTR刺激小鼠骨髓来源M0巨噬细胞从 12h iNOS、IL-6 和 TNF-α高表达，持续性低表达 Arg-1、IL-10 和TGF-β；ELISA结果显示：RTR刺激12 h后TNF-α、iNOS分泌水平开始升高，TGF-β分泌水平降低；FCM结果显示：RTR刺激36h 后巨噬细胞NOS2表面膜分子的表达水平开始升高，CD206 的表达水平降低；提示：RTR 可诱导小鼠骨髓来源M0型巨噬细胞向M1型极化。 2. 高效液相等技术结果显示，RTR全草中含量高于0.01%的单体化合物达50余种；结合文献报道，筛选出与炎症相关化合物：棕榈酸(PA)、小毛茛内酯(Tern)、豆甾醇、2-脱氧-D-核糖酸-1,4-内酯；Real-time PCR结果显示：PA、Tern诱导后M1型相关细胞因子 mRNA的相对表达水平较高，均呈现上调表达；提示：PA和Tern可能参与RTR诱导巨噬细胞极化过程。 3. 不同浓度的PA、Tern分别诱导小鼠骨髓来源M0型巨噬细胞24h， CCK8结果显示：PA浓度不高于400μmol/L时对巨噬细胞活性无影响，Tern浓度不高于150mmol/L 时对巨噬细胞活性无影响；形态学显示：400μmol/L PA、150mg/L Tern诱导后巨噬细胞呈长梭形；分别以400μmol/L PA、150mg/L Tern 诱导M0巨噬细胞0-72h进行后续实验。Real-time PCR检测结果显示：M1型相关细胞因子mRNA的相对表达水平呈高表达状态。ELISA结果显示： PA诱导后，TNF-α、iNOS分泌水平较对照组升高，TGF-β分泌水平较对照组降低；FCM结果显示：PA诱导组，巨噬细胞NOS2表面膜分子的表达水平升高，Tern诱导组，巨噬细胞CD86表面膜分子高表达，CD206的表达水平降低；提示：PA/Tern可诱导小鼠骨髓来源巨噬细胞M1型极化。 4. 根据PA/Tern成分比例，分别以9.5μmol/L PA和75mmol/L的Tern分别诱导小鼠骨髓来源M0型巨噬细胞0-72h，结果显示：75mmol/L的Tern诱导组Real-time PCR发现：抑炎性细胞因子(Arg-1、IL-10、TGF-β)呈现低表达状态；促炎性细胞因子(iNOS、白介素-6 和肿瘤坏死因子-α)表达较对照组明显升高，FCM显示：CD86呈高表达状态；CD206持续性低表达；而PA诱导组无明显变化；提示：RTR诱导小鼠骨髓来源巨噬细胞M1型极化过程中，Tern起主导作用。5.以9.5μmol/L PA和75mmol/L Tern共同作用于小鼠骨髓来源M0型巨噬细胞0-72h，Real-time PCR检测iNOS、IL-6和TNF-α高表达；Arg-1、IL-10、TGF-β低表达；FCM检测结果显示：NOS2高表达；CD206低表达；提示：RTR诱导小鼠骨髓来源巨噬细胞M1型极化，可能是PA与Tern共同作用的结果。 6. Western blot检测信号通路相关蛋白的表达水平，RTR、PA、Tern分别诱导M0型小鼠骨髓来源巨噬细胞24 h、48 h后，NF-κB、p-p38-MAPK的表达明显上调。且较PA、Tern诱导后的表达水平高表达；提示：RTR诱导小鼠骨髓来源巨噬细胞M1型极化可能与MAPK、NF-κB信号通路相关。 结论： 1. 猫爪草醇提取物可促进小鼠骨髓来源M0型巨噬细胞向M1型极化。 2. 猫爪草醇类提取物中诱导巨噬细胞M1型极化的主要成分是棕榈酸和小毛茛内酯，且两者发挥协同促进作用。 3. 猫爪草醇类提取物、棕榈酸、小毛茛内酯诱导巨噬细胞M1型极化可能与NF-κB/p38-MAPK信号通路相关。

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