酪氨酸裂解酶催化活性多样性及赛普霉素生物合成机制研究

摘要

S-腺苷甲硫氨酸自由基酶参与生物体中很多重要的生化反应，其反应机制是裂解SAM产生5-Ado自由基攫取底物的H原子，但也有不同反应机理的酶如MqnE发生自由基加成反应，而很多含有核苷单元的化合物是具有良好的生物活性。对NosL酶的研究发现利用含有双键的色氨酸类似物能够改变酶的反应性发生自由基加成反应。本论文为研究酪氨酸裂解酶催化活性的多样性，选取的四种酪氨酸裂解酶FbiC、HydG、ThiHEc和ThiHCb，并合成了S-腺苷甲硫氨酸（SAM）类似物S-鸟苷甲硫氨酸（SGM）和S-胞苷甲硫氨酸（SCM）以及底物酪氨酸的烯烃类似物2-（4-羟基）丙烯酸（HBAA）和2-（4-羟基）丙烯酸甲酯（MHBA）进行反应，研究其催化活性。结果表明四种酶都具有识别HBAA和（或）MHBA并生成腺苷加成产物的能力，且FbiC能够生成鸟苷加成产物。本文的研究拓宽了对Radical SAM酶催化活性的研究，使合成具有生物活性的含不同核苷单元的化合物成为可能。
　　赛普霉素（Cypemycin）是一类具有抗哺乳动物白血病肿瘤细胞活性的核糖体合成翻译后修饰多肽（Ripps），同时还具有良好的抗微生物活性。自1993年cypemycin首次报道以来其生物合成基因簇已被广泛研究，推测其中CypH和CypL酶与cypemycin分子中苏氨酸脱水形成Dhb及半胱氨酸的脱水有关，但功能仍然有待表征。为研究CypH和CypL两个酶的功能，本论文克隆并成功表达了其前体肽CypA，设计体内及体外修饰实验，检测到了一段大小为3461Da的肽段，推测是由前体肽部分酶解并发生一个苏氨酸脱水而形成，在体外修饰时苏氨酸脱水导致前体肽易被降解，无法继续进行修饰。这一发现对cypemycin生物合成机制的研究提供了重要信息，其研究方法也可以应用到其他核糖体肽的生物合成研究中，同时也可以用于发现并组合生物合成更多结构新颖，活性良好的此类天然产物，为未来生物医药的发展提供重要的理论依据。

目录

声明

缩略语表

第一章 引言

1.1.S-腺苷甲硫氨酸自由基酶（Radical SAM酶）

1.1.1. Radical SAM酶的结构特征

1.1.2. Radical SAM酶的催化活性

1.1.3. Radical SAM酶催化的自由基加成反应

1.1.4. 酪氨酸裂解酶的催化活性

1.2.核糖体合成翻译后修饰多肽类天然产物发现及其生物合成

1.2.1. RiPPs生物合成途径

1.2.2. RiPPs的分类

1.2.3. 线性肽

第二章 材料与方法

2.2. 酪氨酸裂解酶催化活性多样性实验材料与方法

2.1.1. 菌种与质粒

2.1.2. 引物

2.1.3. 药品与试剂

2.1.4. 菌株培养及菌种保藏

2.1.5. 碱裂解法提取大肠杆菌质粒DNA

2.1.6. PCR反应

2.1.7. DNA电泳及其胶回收

2.1.8. DNA酶切与体外连接

2.1.9. 大肠杆菌感受态细胞的制备

2.1.10. DNA转化大肠杆菌

2.1.11. 大肠杆菌中蛋白与多肽的表达

2.1.12. 大肠杆菌中表达蛋白的纯化、浓缩与保存

2.1.13. Radical SAM酶的体外重构

2.1.14. Radical SAM酶的体外酶活性检测

2.1.15. HPLC-MS检测

2.2. 赛普霉素生物合成机制研究实验材料与方法

2.2.1. 菌种与质粒

2.2.2. 引物

2.2.3. 药品与试剂

2.2.4. 提取链霉菌基因组总DNA

2.2.5. 链霉菌与大肠杆菌属间接合转移

2.2.6. 大肠杆菌中表达多肽的纯化、浓缩与保存

2.2.7. 链霉菌中多肽的表达和纯化

2.2.8. 多肽的体外修饰反应

第三章 实验结果

3.1.酪氨酸裂解酶催化活性多样性实验结果

3.1.1. Radical SAM酶裂解SAM及其类似物反应活性

3.1.2. Radical SAM酶与底物类似物反应

3.2.赛普霉素生物合成机制研究结果

3.2.1. 前体肽CypA的可溶性表达

3.2.2. CypA大肠杆菌体内修饰

3.2.3. CypA体外修饰反应

第四章 讨论

4.1.酪氨酸裂解酶酶学活性多样性实验结果讨论

4.2.赛普霉素生物合成研究实验结果讨论

第五章结论与展望

参考文献

在学期间的研究成果

致谢