δ-GABAA受体对脊髓背角LTP及炎性疼痛的抑制作用

摘要

目的：包含δ亚基的γ-氨基丁酸A型受体（δ-GABAARs,δ-subunit-containingγ-Aminobutyric acid type A receptors）位于突触外膜，对神经元兴奋性有着持久的负性调控作用。有研究发现，δ-GABAARs在脊髓背角神经元中表达。外周神经损伤引发脊髓δ-GABAARs的表达减少，使 GABA 能持久性抑制（tonic inhibition）减弱，构成了中枢敏化的重要因素。中枢敏化不仅与神经元兴奋性有关，还与突触效能的持续增强密切相关。然而，δ-GABAARs是否调控突触效能 并 不 清 楚 ，本 研 究 将 利 用 δ-GABAARs的特 异 性 激 动 剂 4,5,6,7-tetrahydroisoxazolo [5,4-c] pyridine-3-ol（THIP），探究脊髓背角的δ-GABAARs对痛觉突触传递、突触可塑性以及福尔马林诱发疼痛的可能作用及其机制。 方法：通过细胞外记录脊髓背角初级传入C纤维诱发的场电位，探究δ-GABAARs的激活对痛觉突触传递和突触可塑性的影响。利用后足皮下注射福尔马林建立自发性疼痛模型，探究δ-GABAARs的激活对动物自发性疼痛及机械性痛觉过敏的影响。利用蛋白质免疫印迹法（Western Blotting），探究δ-GABAARs调控福尔马林诱发疼痛的可能分子机制。 结果：（1）给正常大鼠脊髓背角滴加0.1-0.5μg THIP，可剂量依赖性地缩减C纤维诱发突触反应的面积（C反应面积）。提示：THIP抑制脊髓背角痛觉突触传递。（2）给脊髓滴加0.2μg THIP预处理1 h，显著抑制LFS引起的C反应面积的增大。提示：THIP抑制脊髓背角C纤维诱发电位LTP的产生。（3）在LFS诱发LTP 30 mins后，给脊髓滴加0.2μg THIP，可显著抑制C反应面积的增大，并且此效应可维持至记录结束。提示：THIP抑制脊髓背角诱发电位LTP的早期维持。（4）在LFS诱发LTP 3 h后，给脊髓背角滴加0.2μg THIP，也显著抑制C反应面积的增大。提示：THIP抑制脊髓背角诱发电位LTP的晚期维持。（5）足底注射50μl 2.5%福尔马林可诱发出LTP。脊髓滴加0.2μg THIP预处理1 h则明显抑制福尔马林的这种效应。提示：THIP可抑制福尔马林诱发的LTP。（6）给大鼠鞘内注射0.1-0.5μg THIP，30 mins后左足注射福尔马林，不影响Ⅰ 相反应（0-15 mins），但可剂量依赖性地抑制Ⅱ相反应（15-60 mins）。给小鼠注射0.01-0.2μg THIP也产生相同效应。提示：THIP可有效抑制福尔马林诱发的Ⅱ相自发性痛觉反应。（7）给动物右后足足背皮下注射福尔马林3天后，鞘内注射THIP（0.1-0.5μg），显著抑制250 mN Von Frey纤维引发的撤足现象，提示：THIP缓解福尔马林所诱发的机械性痛觉过敏。（8）大鼠足底注射福尔马林作用30 mins，显著提高脊髓背角α-氨基-3-羟基-5-甲基-4异恶唑受体（AMPARs,α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole-propionic acid receptor)GluA1亚基的突触含量和第831位丝氨酸（Ser 831）的磷酸化水平，但显著降低AMPARs GluA2亚基的突触含量；提前鞘内注射THIP可显著抑制福尔马林的这些作用。提示：THIP激活δ-GABAARs后，抑制GluA1-AMPARs的突触表达并使突触中的AMPARs由GluA2缺乏型变成GluA2富集型。（9 ）给大鼠足底注射福尔马林作用30 mins ，可显著提高 N-甲基-D-天冬氨酸受体（NMDARs，N-methyl-D-aspartate receptor）亚基GluN1的突触含量和第896位丝氨酸（Ser 896）的磷酸化水平，而提前鞘内注射THIP则显著抑制福尔马林的这种效应。提示：THIP激活δ-GABAARs可抑制NMDARs的突触表达。 结论：脊髓中的δ-GABAARs对C纤维介导的痛觉突触传递以及突触可塑性起负性调控作用，其激活可有效减缓福尔马林诱发的Ⅱ相自发性疼痛和机械性痛觉过敏。

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第一章 前言

1.1 GABAA受体

1.1.1 GABAA受体的结构与功能

1.1.2 GABAA受体与疼痛

1.1.3 GABAA受体的转运

1.2 AMPA受体

1.2.1 AMPA受体的结构与功能

1.2.2 AMPA受体的转运

1.2.3 AMPA受体与LTP

1.3 NMDA受体

1.3.1 NMDA受体的结构与功能

1.3.2 NMDA受体的转运

1.3.3 NMDA受体与LTP

第二章 实验材料与实验方法

2.1实验准备

2.1.1 实验动物来源及数量

2.1.2 实验试剂与抗体

2.1.3 溶液配制与使用

2.1.4 实验器材与仪器

2.2实验方法及过程

2.2.1 福尔马林疼痛模型的建立

2.2.2 鞘内注射

2.2.3 行为学测试

2.2.4 场电位记录

2.2.5 亚细胞结构的分离

2.2.6 蛋白质免疫印迹法

2.2.7 实验数据的统计与分析

第三章 实验结果

3.1 THIP对脊髓背角痛觉突触传递的影响

3.2 THIP对脊髓背角C纤维诱发电位LTP产生的影响

3.3 THIP对脊髓背角C纤维诱发电位LTP早期维持的影响

3.4 THIP对脊髓背角C纤维诱发电位LTP晚期维持的影响

3.5 THIP对福尔马林诱发的LTP的影响

3.6 鞘内注射THIP对动物运动机能的影响

3.7 THIP对福尔马林诱发的自发性疼痛反应的影响

3.7.1 THIP对小鼠的自发性疼痛反应的影响

3.7.2 THIP对大鼠的自发性疼痛反应的影响

3.8 THIP对福尔马林诱发的机械性痛觉过敏的影响

3.9 THIP对大鼠脊髓背角突触中AMPA受体表达的影响

3.9.1 THIP对AMPA受体突触表达的影响

3.9.2 THIP对AMPA受体磷酸化水平的影响

3.10 THIP对大鼠脊髓背角突触中NMDA受体表达的影响

3.10.1 THIP对NMDA受体突触表达的影响

3.10.2 THIP对NMDA受体磷酸化水平的影响

第四章 讨论

4.1 δ-GABAA受体对痛觉的调控作用

4.2 δ-GABAA受体对谷氨酸能突触传递的影响

4.3 δ-GABAA受体对突触可塑性的影响

第五章 结论与展望

5.1 结论

5.2 展望

参考文献

在学期间的研究成果

一、发表论文

二、参与课题

致 谢