Osteopontin促进人胃癌细胞存活与侵袭转移的分子机制研究

摘要

Osteopontin(OPN)是最早从骨基质中分离得到的一种分泌型、粘附性的钙结合磷酸化糖蛋白。OPN通过与其主要的受体整合素和CD<,44>相互作用，参与多组织、多器官的生理病理过程。近年发现OPN还是一种与肿瘤发生发展密切相关的多功能细胞外基质蛋白。OPN在乳腺癌、前列腺癌、肝癌、结肠癌、食管癌、肺癌和神经胶质瘤等许多肿瘤组织中高表达，并提示OPN与肿瘤细胞存活、侵袭转移和血管生成密切相关。胃癌是中国最常见的发病率和死亡率很高的恶性肿瘤之一。胃癌的发生发展涉及到多基因的改变，包含抑癌基因失活，癌基因的扩增及肿瘤转移相关基因的异常表达等。前人研究发现OPN mRNA在胃癌组织中的表达较正常胃粘膜组织高。然而，OPN在胃癌发生发展中的功能及其作用机制并不清楚。 我们首先利用免疫组织化学染色的方法在非胃癌组织和胃癌组织中检测了OPN、MMP9、H巧-1α和CD34的表达和分布。结果显示，在非胃癌组织中均未能检测到OPN、MMP9和HIF-1 α的表达。胃癌组织中MvD显著高于正常胃粘膜组织，而且发现OPN、MMP9或HIF-1α表达量高的胃癌组织中，MVD值就越高。统计学方法分析，OPN、MMP9、HIF-1α和MVD在有、无淋巴结转移的胃癌组织中或在高、低分化腺瘤中的阳性表达率均呈显著性差异(p<0.05)。相关性分析表明OPN与MMP9和HIF-1α的表达分别具有相关性(r=0.872，p<0.01和r=0.878，p<0.01)，提示OPN、MMP9和HIF-1α在胃癌的发生发展进程中的作用是相互关联的。 为进一步探讨OPN在胃癌细胞存活与侵袭、转移中的作用机制，我们构建了稳定表达OPN的人胃癌OPN/SGC7901细胞株和转染空载体的Vec/SGC7901细胞株，并以此为研究模型。研究发现，在无血清和姜黄素诱导生存压力条件下，OPN均可通过激活PI3-K/Akt信号通路来拮抗细胞凋亡，促进胃癌SGC7901细胞存活，通过外源重组的OPN蛋白刺激，我们也得到了同样的结果。进一步用α<,v>β<,3>抗体阻断OPN与其结合，发现Akt磷酸化水平降低，说明在压力条件下，OPN可通过与整合素α<,v>β<,3>结合激活：PI3-K/Akt信号通路，从而促进胃癌细胞SGC7901的存活。 在利用CoCl<,2>模拟缺氧的条件下，我们发现200/μM COCl<,2>模拟的轻度缺氧可以拮抗无血清诱导的细胞凋亡，并发现OPN和HIF-1α的表达上调，Akt的磷酸化水平增高。进一步发现，无论在正常有氧条件下，还是在缺氧的条件下，过表达的OPN和外源重组的OPN蛋白刺激均可上调胃癌SGC7901细胞内HIF-1α蛋白的水平和Akt的磷酸化水平，且发现PI3-K/Akt信号通路被抑制后，可降低OPN诱导SGC7901细胞内HIF-1α表达。说明OPN通过激活PI3-K/Akt信号通路来上调SGC7901细胞内HIF-1α蛋白的水平，可能是促进细胞的存活的一条重要途径，而且这一途径是不依赖缺氧的。 另外，通过一系列细胞侵袭转移的细胞学实验，结果表明OPN可促进胃癌SGC7901细胞的迁移侵袭和集落形成。裸鼠皮下成瘤和尾静脉注射的实验结果也显示，OPN不仅可促进胃癌细胞的生长，而且可促进胃癌细胞向肠和肺部转移。通过免疫组织化学检测裸鼠皮下瘤OPN、MMP9和CD34的表达，发现OPN与MMP9的表达和MVD分别与OPN的表达相关，说明OPN不仅具有促进胃癌细胞侵袭转移的功能，而且在促进血管形成方面发挥重要作用。在分子水平上，发现OPN可上调胃癌细胞pro-MMP2的表达和激活pro-MMP9。结合前面的研究结果提示OPN可能通过其受体α<,v>β<,3>介导MMP9的激活促进胃癌SGC7901细胞的侵袭转移。 综合上述的研究结果，我们认为OPN可通过其受体α<,v>β<,3>介导激活PI3-K/Akt信号通路并上调HIF-1α和激活MMP9，促进胃癌SGC7901细胞存活和侵袭转移。可见，OPN的高表达对胃癌的发生发展起十分重要的作用。本研究对进一步阐明胃癌发生发展规律，选择OPN作为新的治疗靶点奠定了重要理论基础。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略语对照表

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第1章引言

1.1胃癌发生发展的主要相关基因

1.1.1癌基因与胃癌

1.1.2抑癌基因与胃癌

1.1.3细胞周期调控因子与胃癌

1.1.4转移相关基因与胃癌

1.1.5生长因子及其受体与胃癌

1.1.6 HIF-1与胃癌

1.1.7其它基因与胃癌

1.2 OPN与肿瘤发生发展

1.2.1 OPN的分子结构

1.2.2 OPN在肿瘤中的功能

1.2.3 OPN在肿瘤发生发展中的作用机制

1.2.4 OPN作为靶标的肿瘤治疗

1.3 OPN与胃癌的发生发展

1.4本课题研究的目标、内容和意义

1.4.1研究目标和内容

1.4.2研究意义

第2章实验材料与方法

2.1实验材料

2.1.1质粒、菌株、细胞株、裸鼠、胃癌组织标本

2.1.2工具酶

2.1.3抗体

2.1.4主要化学试剂和耗材

2.1.5哺乳动物细胞培养试剂

2.1.6主要仪器

2.1.7主要溶液配置

2.2实验方法

2.2.1质粒小量提取

2.2.2 PCR扩增目的DNA片段

2.2.3 DNA限制性内切酶酶切

2.2.4胶回收DNA片段（QIAGEN）

2.2.5 DNA连接

2.2.6大肠杆菌感受态细胞制备

2.2.7大肠杆菌转化

2.2.8质粒大量提取

2.2.9细胞培养

2.2.10细胞转染及稳定转染细胞株的建立

2.2.11细胞裂解及蛋白质浓度测定

2.2.12 Western blot

2.2.13细胞苏木精、伊红染色

2.2.14细胞台盼蓝染色

2.2.15 Hoechst 33258和AO/EB染色

2.2.16细胞的存活率测定(MTT法)

2.2.17细胞周期变化及其凋亡细胞的检测

2.2.18 DNA ladder分析

2.2.19软琼脂集落形成实验

2.2.20细胞迁移能力分析—划痕实验

2.2.21细胞侵袭能力分析-Transwell~细胞侵袭实验

2.2.22细胞粘附能力分析

2.2.23 MMP2和MMP9活性分析

2.2.24石蜡切片与免疫组织化学染色

2.2.25肿瘤微血管密度测定

2.2.26裸鼠皮下成瘤和转移实验

第3章OPN、MMP9、HIF-1α和CD34在人胃癌组织中的表达及其相关性分析

3.1结果

3.1.1 OPN在人胃癌组织中的表达及其临床意义

3.1.2 MMP9在人胃癌组织中的表达及其临床意义

3.1.3 HIF-1α在人胃癌组织中的表达及其临床意义

3.1.4人胃癌组织中肿瘤微血管密度(MVD)及其临床意义

3.1.5 OPN、MMP9、HIF-1α和MVD之间的相关性分析

3.2讨论

3.3小结

第4章OPN通过αvβ3介导激活PI3-K/Akt通路拮抗生存压力诱导胃癌细胞凋亡

4.1结果

4.1.1 pcDNA3.1(-)/OPN表达载体的构建

4.1.2 OPN对胃癌细胞生长及细胞周期分布的影响

4.1.3姜黄素诱导胃癌SGC7901细胞凋亡

4.1.4 OPN拮抗姜黄素诱导的胃癌SGC7901细胞凋亡

4.1.5 OPN激活Akt通路促进胃癌细胞SGC7901细胞存活

4.1.6 OPN通过αvβ3介导激活PI3-K/Akt促胃癌SGC7901细胞存活

4.2讨论

4.3小结

第5章OPN激活PI3-K/Akt通路上调HIF-1α促进胃癌细胞存活不依赖缺氧

5.1结果

5.1.1 CoCl2模拟缺氧对胃癌SGC7901细胞生长的影响

5.1.2 OPN促进胃癌SGC7901细胞存活不依赖缺氧

5.1.3缺氧上调胃癌SGC7901细胞中HIF-1α、OPN和VEGF的表达

5.1.4 OPN激活Akt通路和上调HIF-1α不依赖于缺氧

5.1.5 OPN通过激活PI3-K/Akt通路上调HIF-1α

5.2讨论

5.3小结

第6章OPN激活MMP9促进胃癌细胞侵袭转移

6.1结果

6.1.1过表达OPN对胃癌SGC7901细胞克隆形成的影响

6.1.2过表达OPN对胃癌SGC7901细胞与基质粘附能力的影响

6.1.3过表达OPN对胃癌SGC7901细胞侵袭、迁移能力的影响

6.1.4 OPN对MMP2和MMP9在胃癌SGC7901细胞中表达的影响

6.1.5 OPN对胃癌细胞SGC7901裸鼠体内致瘤、转移能力的影响

6.1.6 OPN和MMP9在裸鼠荷胃癌肿瘤组织中的表达

6.1.7 CD34在裸鼠荷胃癌细胞的肿瘤组织中表达

6.2讨论

6.3小结

结论

参考文献（References）

附录1 The activation of Akt/PKB signaling pathway and cell survival

附录2 Curcumin induces human HT29 colon adenocarcinoma cell apoptosis via activating p53 and regulating apoptosis-related protein expression

致谢

个人简历