维甲酸诱导人成骨肉瘤MG-63细胞分化过程中核基质构型及其蛋白组成变化研究

摘要

本文在鉴定维甲酸(retinoicacid，RA)诱导人成骨肉瘤MG-63细胞终末分化的基础上，应用选择性抽提、整装透射电镜和蛋白质组学分析技术，对MG-63细胞诱导分化过程中核基质-中间纤维系统的构型变化和核基质蛋白组成的变化进行系统研究。分析鉴定与肿瘤增殖分化相关的特异核基质蛋白，并探索它们在肿瘤细胞诱导分化过程中的调控作用，以期能够在较为整体的水平上进一步认识细胞癌变与逆转机理，从而找出细胞增殖与分化调控研究的新方向。 实验结果显示，经1μmol/LRA处理之后，人成骨肉瘤MG-63细胞的增殖受到了明显抑制，发生了G0/G1期阻滞，细胞形态改变的同时伴随着癌基因c-myc、c-fos的表达下调和抑癌基因Rb、p27的上调表达。并且RA能够促进MG-63细胞Ⅰ型胶原、骨钙蛋白、骨粘素和骨结节等骨特异性标志物的表达和形成。选择性抽提整装透射电镜观察显示经RA处理后MG-63细胞的核基质-中间纤维系统构型发生了恢复性变化，由肿瘤细胞核基质不规则聚积的纤维结构转变为层次分明、精细发达的网状结构。双向凝胶电泳分析显示在RA诱导MG-63细胞分化前后存在43个差异表达的核基质蛋白，经质谱分析，鉴定了其中的25个蛋白。其中在分化的MG-63细胞中表达下调的蛋白鉴定为热休克蛋白HSP70，Cyclin折叠蛋白1，actin，14号染色体ORF10编码的蛋白，转录延伸因子A，nucleophosmin蛋白，hnRNPA2/B1和prohibitin;表达上调和新出现的蛋白质为锌指蛋白ZNF710，ZYG11B蛋白，孤儿核受体NR1D2，RAS家族RAB3D蛋白，Rb结合蛋白RBBP7，vimentin，泛素化水解酶UCHinteractingprotein，MHCⅠ类抗原，类CDK蛋白3，免疫球蛋白超家族成员DORA蛋白和泛素相关蛋白sentrin家族成员SUMO-4。其中除vimentin，actin，HSP70，nucleophosmin和RBBP7外，均属首次在核基质中发现。 研究结果表明，1μmol/LRA对人成骨肉瘤MG-63细胞的终末分化具有显著诱导作用，在MG-63细胞分化过程中不仅其核基质-中间纤维系统构型产生了与其相应正常细胞相似的恢复性变化，而且其核基质蛋白组成也相应发生了明显变化。由此证实了与肿瘤细胞增殖分化相关特异核基质蛋白的存在及其对肿瘤细胞增殖分化的调控作用。

目录

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摘要

前言

1.肿瘤细胞诱导分化及其机理研究

2.核基质与核基质蛋白在细胞增殖与分化过程中的重要调控作用

3.人成骨肉瘤细胞及其终末分化研究

4.本文研究目的及其解决的主要问题和科学意义

材料与方法

1.细胞培养与诱导分化处理

2.细胞生长曲线测定

3.细胞周期分析

4.细胞形态光学显微镜样品的制备与观察

5.癌基因、抑癌基因蛋白的免疫细胞化学观察

6.成骨细胞终末分化指标的观察

7.核基质-中间纤维选择性抽提样品的制备与观察

8.人成骨肉瘤细胞核基质蛋白的选择性抽提

9.核基质蛋白双向凝胶电泳分析

10.差异核基质蛋白点MALDI-TOF质谱鉴定

结果

1.RA对人成骨肉瘤MG-63细胞增殖的抑制作用

2.RA对人成骨肉瘤MG-63细胞形态的影响

3.RA对人成骨肉瘤MG-63细胞癌基因、抑癌基因表达的影响

4.RA对人成骨肉瘤MG-63细胞终末分化指标表达的影响

5.RA对人成骨肉瘤MG-63细胞核基质-中间纤维系统的影响

6.RA对人成骨肉瘤MG-63细胞核基质蛋白表达的影响

讨论

1.RA对人成骨肉瘤MG-63细胞诱导终末分化的效果

2.RA对人成骨肉瘤MG-63细胞分化过程中核基质-中间纤维系统构型变化的影响

3.RA诱导人成骨肉瘤MG-63细胞分化过程中特异核基质蛋白及其变化

4.特异核基质蛋白在人成骨肉瘤MG-63细胞癌变与逆转过程中的作用

5.RA诱导人成骨肉瘤MG-63细胞终末分化的作用机制

结论

参考文献:

图版

附录：硕士期间发表的论文

致谢