红树林土壤微生物卤代酶基因和宏基因组非核糖体肽合酶基因的克隆和表达

摘要

红树林是分布于热带、亚热带海岸的潮间带的木本植物群落，是海滩上特有的森林类型。红树林生态系统具有高生产率，高归还率，高分解率的“三高”特点。微生物是红树林生态系统中重要的生物组成成份，它在红树林生态系统的能量物质循环中起着关键的作用。由于红树林生态系统处于咸淡水交汇的特殊环境，兼具海洋与陆地的性质，因而其中的微生物形成了独特的生长代谢调控机制和化学防御机制，其独特的代谢产物也将成为我们获取新型天然产物的资源宝库。 首先，用不同的针对卤代酶基因设计的引物对分离自红树林土壤的放线菌进行筛选，发现其中含有丰富的卤代酶基因，且类型多样。由此推测这些放线菌具有产生类型多样的卤代化合物的潜力。并对其中的几个FADH2依赖型卤代酶进行表达，试图阐明其催化机制，但一直无法实现可溶性表达。 在对分离自红树林土壤沉积物的放线菌进行卤代酶基因筛选时，发现MGR072菌株中的卤代酶基因与Actinosynnema pretiosum subsp.Auranticum中卤代酶基因asm12的相似性为64％，另外用针对安莎类抗生素起始合成酶AHBA合酶基因设计的引物对其进行扩增，发现AHBA合酶基因扩增结果为阳性。综合以上结果，推测其中含有合成安莎类抗生素的生物合成基因簇，构建了其基因组文库，发掘出其中与安莎类抗生素生物合成相关的约70Kb的基因簇。并对其培养条件进行了初步的研究。 我们还构建了含有至少260Mb红树林沉积物环境样品DNA的沉积物宏基因组文库，并利用序列同源性驱动筛选方法对其中所含有的NRPS基因加以系统的发掘和整理，发现了克隆4F11可能包含一段完整的NRPS基因簇。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略语

声明

第一章前言

1.1红树林土壤微生物次生代谢产物研究概况

1.1.1红树林微生物多样性

1.1.2红树林微生物次生代谢产物多样性

1.1.3展望

1.2卤代酶研究进展

1.2.1卤代酶的分类

1.2.2卤代酶的应用研究

1.2.3展望

1.3本论文的研究目的及意义

第二章红树林放线菌卤代酶基因的克隆和异源表达

2.1 研究背景

2.2材料与方法

2.2.1材料

2.2.2方法

2.3结果与分析

2.3.1卤代酶基因筛选

2.3.2含卤代酶基因菌株中抗生素生物合成相关基因的检测

2.3.3卤化酶基因阳性菌株次生代谢产物的检测

2.3.4卤代酶基因的克隆、表达及活性检测

2.4本章小结

第三章红树林放线菌MGR072菌株的安莎类抗生素生物合成基因簇的克隆及发酵培养条件的初步研究

3.1 研究背景

3.2 材料与方法

3.2.1材料

3.2.2方法

3.3 结果与分析

3.3.1 MGR072菌株中安莎类抗生素相关生物合成基因的克隆

3.3.2 MGR072菌株基因组fosmid文库的构建及评估

3.3.3基因组文库中安莎类抗生素相关生物合成基因的筛选及定位

3.3.4克隆5G2序列分析

3.3.5各种培养基产物活性检测

3.3.6 RT-PCR检测AHBA基因的转录

3.3.7豆饼粉培养基液体发酵产物的分离纯化

3.4 本章小结

第四章红树林土壤宏基因组文库的构建及潜在抗生素生物合成基因的筛选

4.1 研究背景

4.2 材料与方法

4.2.1材料

4.2.2方法

4.3 结果与分析

4.3.1红树林土壤沉积物宏基因组文库的构建及评估

4.3.2 宏基因组文库中抗生素生物合成相关基因的筛选

4.4 本章小结

小结与展望

参考文献

附 录

致谢