P49抗原基因及Caenorhabditis elegans homologus基因在旋毛虫中的研究

摘要

旋毛虫是一种重要的人兽共患寄生虫，寄生于人体可导致严重的疾病。为了了解我国几个不同地区旋毛虫之间的种属关系，我们对这些地区的旋毛虫进行了线粒体细胞色素氧化酶亚单位I(COI)基因的扩增，并得到了正确的COI基因。利用ClusterX、Genedoc等软件我们对这些COI基因序列进行了分析，构建了遗传距离矩阵及系统发生树。分析可知，T1与东北株COI基因的相似性高达97.9％，遗传距离仅为0.0081，两者的同源性非常高。T2与T5株COI基因的相似性为95.0％，遗传距离为0.0412，同源性也很高，两者与T3株有一定的差别。湖北株与云南株的遗传距离为0.0000，两者的同源性最高。而河南株与其它几种的差异均比较大，这是由什么原因造成的有待研究。因此COI基因可作为鉴定旋毛虫亲缘关系远近的有效工具。 以旋毛虫基因组DNA为模板，我们扩增与C.eleganslin-28基因同源的片段，将序列与C.eleganslin-28的部分序列在Genedoc软件中进行比对和分析，同源性达到93％以上，说明旋毛虫中存在lin-28同源基因。因此，我们利用原位杂交技术研究了lin-28及与其相关的3个异时性基因在旋毛虫中的分布情况。在胚胎、5日成虫体内都检测到lin-28mRNA的存在，在早期胚胎中均匀分布于细胞质中，随着胚胎发育和细胞数目的增多而减少，在成虫期分布于虫体的头部及咽部。let—7mRNA在早期胚胎中的分布与lin-28mRNA的分布类似，但在中晚期逐渐分布于胚胎四周至幼虫形成期仍有微量表达，在成虫中主要分布于头咽部和尾部。lin—4mRNA主要在胚胎早中期均匀分布，晚期则多见于四周，成虫仅见于头咽部。lin—14mRNA在胚胎内分布与lin-28mRNA相同，成虫中也多位于头咽部，10日成虫尾部也有分布。此外，let—7mRNA及lin—4mRNA分别在肌肉幼虫虫体2/5处也有分布。 为了解旋毛虫排泄分泌抗原中P49抗原的功能，我们对旋毛虫的P49抗原基因进行了克隆和表达鉴定。我们利用3’RACE法对旋毛虫P49抗原基因的cDNA进行了扩增，获得的cDNA片段大小为1100bp。进行了P49抗原基因的cDNA克隆和筛选，获得的阳性质粒进行了酶切验证和测序。将序列正确的重组质粒酶切后利用融合表达载体pGEX构建了P49重组表达质粒并转化到BL21(DE3)中进行表达。利用IPTG(1mmol/L)进行了诱导表达，运用SDS—PAGE凝胶电泳对表达结果进行了分析，发现重组P49融合蛋白分子量大小约为60KDa。并进行了重组蛋白的纯化和免疫获得了相应的抗体。利用westernblot分析了该蛋白在不同发育时期的表达情况，发现P49在旋毛虫的成虫和肌肉幼虫中均有表达，且肌肉幼虫中较多。此外，通过构建p49—L4440质粒，我们对C.elegans进行了RNAi，发现P49RNAi后C.elegans寿命明显缩短。 为了更好的了解旋毛虫的基因组信息及筛选控制旋毛虫的靶基因，我们以旋毛虫EST库及C.elegans基因组信息为依据设计了一系列引物进行3’RACEPCR扩增，得到了3个基因的cDNA片段。克隆后测序并通过序列分析发现，它们翻译得到的蛋白与C.elegans中CDC42、RNP、MRP—L28蛋白的相似性分别为71％、40％和57％，并且发现其中CDC42蛋白有该蛋白家族的保守区，RNP蛋白有该蛋白家族特有的RNA识别结构域。