乙醇酸氧化酶重组毕赤酵母的构建及其催化合成乙醛酸工艺条件初步优化

摘要

乙醇酸氧化酶(glycolate oxidase，GO)是一种黄素蛋白酶，它以氧作为电子受体，能催化乙醇酸至乙醛酸的氧化反应。产物乙醛酸是一种重要的化工中间体，可以广泛应用于医药、香料、农药等领域。生物法合成乙醛酸具有污染少，转化率高，产品纯度高等优点，因此是很有前途的合成乙醛酸工艺路线。目前生物法合成乙醛酸主要是利用乙醇酸氧化酶将乙醇酸氧化成乙醛酸，同时利用过氧化氢酶消除反应产生的过氧化氢，防止产物的进一步氧化。本研究目的在于通过构建基因工程菌来催化合成乙醛酸，主要内容包括GO的毕赤酵母重组菌构建、重组菌的发酵条件、重组菌催化合成乙醛酸条件。 从新鲜菠菜叶中提取总RNA，利用RT—PCR技术获得编码GO基因的cDNA片断。通过基因重组将GO基因克隆到载体pAO815中，构建了胞内表达载体pAO815/GO。重组质粒以BglⅡ线性化后电转整合至甲醇营养酵母GS115染色体。胞内蛋白采用SDS—PAGE电泳分析，结果显示诱导表达蛋白的分子量约为40kDa。甲醇诱导重组菌表达，并对诱导的条件进行优化，确定最佳的pH为6.0，最佳的表达时间为96h，最佳混合碳源为10g/L山梨醇和0.5g/L甲醇。在最佳的培养条件下，细胞的GO酶活达到147IU/g湿菌体。 重组毕赤酵母表达了乙醇酸氧化酶，并且毕赤酵母胞内含有过氧化氢酶，所以重组毕赤酵母可以用于合成乙醛酸。采用重组毕赤酵母作催化剂，乙醇酸为原料，对乙醛酸的合成条件进行了研究，并优化获得了较佳的工艺条件。结果表明：在乙醇酸浓度为0.20mol/L，重组酵母湿菌体为10g/L，黄素单核苷酸(FMN)浓度为0.01mmol/L，pH7.6，通入空气速率0.015m3/(L．h)，25℃反应96h，乙醛酸的产率达到85.0％。

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第一章综述

1.1乙醛酸的性质及用途

1.2乙醛酸的化学合成进展

1.2.1乙二醛氧化法

1.2.2顺酐臭氧氧化法

1.2.3草酸电解还原法

1.2.4乙醇酸无机物催化氧化法

1.3乙醛酸的生物法合成进展

1.3.1乙醇酸氧化酶

1.3.2乙醇酸氧化酶催化作用机理

1.3.3酶法生产乙醛酸

1.3.4微生物法生产乙醛酸

1.4乙醇酸氧化酶的克隆表达

1.4.1用Escherichia.coli表达乙醇酸氧化酶

1.4.2用Saccharomyces cerevisiae表达乙醇酸氧化酶

1.4.3用Asperigillus nidulans表达乙醇酸氧化酶

1.4.4用Hansenula polymorpha表达乙醇酸氧化酶

1.4.5用Pichia pastoris表达乙醇酸氧化酶

1.5毕赤酵母表达系统

1.5.1毕赤酵母表达外源蛋白的优点

1.5.2毕赤酵母生物学特性

1.5.3毕赤酵母表达体系的载体类型

1.5.4外源基因的整合方式

1.5.5影响外源蛋白高效表达的因素

1.6毕赤酵母碳源控制策略

1.7本课题的研究思路和目的

第二章乙醇酸氧化酶表达载体的构建与鉴定

2.1前言

2.2实验材料与仪器

2.2.1主要仪器

2.2.2主要试剂

2.2.3菌株和质粒

2.2.4培养基和常用溶液

2.3实验方法

2.3.1总RNA的提取

2.3.2 RT-PCR反应

2.3.3琼脂糖凝胶电泳

2.3.4PCR产物的凝胶回收

2.3.5酶切反应

2.3.6酶切产物的回收

2.3.7目的片断和pA0815载体的连接反应

2.3.8感受态细胞的制备

2.3.9细菌的转化

2.3.10菌落PCR

2.3.11重组质粒的提取

2.4结果与讨论

2.4.1重组质粒构建示意图

2.4.2目的基因的RT-PCR扩增及鉴定

2.4.3 酶切产物回收

2.4.4菌落PCR鉴定

2.4.5重组子的酶切鉴定

2.4.6序列测定及同源分析

2.5小结

第三章乙醇酸氧化酶在毕赤酵母中的表达

3.1前言

3.2实验材料与仪器

3.2.1主要仪器

3.2.2主要试剂

3.2.3常用培养基和溶液

3.3实验方法

3.3.1重组质粒的线性化

3.3.2感受态毕赤酵母的制备

3.3.3毕赤酵母的电转化

3.3.4转化子的表型鉴定

3.3.5重组毕赤酵母的培养表达

3.3.6 SDS—PAGE电泳

3.3.7发酵条件的优化

3.3.8生物量测定

3.3.9酶活测定

3.4结果与讨论

3.4.1电转化

3.4.2转化子的显型鉴定

3.4.3乙醇酸氧化酶的表达

3.4.4发酵条件的优化

3.5小结

第四章重组毕赤酵母合成乙醛酸的研究

4.1前言

4.2实验材料与仪器

4.2.1主要仪器

4.2.2主要试剂

4.3实验方法

4.3.1重组酵母菌的通透处理

4.3.2反应条件优化

4.3.3产品分析

4.4结果与讨论

4.4.1乙醇酸、乙醛酸色谱分离分析

4.4.2反应条件对乙醛酸合成的影响

4.5小结

第五章结论与展望

参考文献

致谢

研究生期间发表和待发表的学术论文