A型流感病毒非结构蛋白NS1与PI3K调节亚基P85β蛋白的相互作用研究

摘要

磷脂酰肌醇-3激酶(Phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)是在众多被激活信号通路中起到枢纽作用的关键蛋白分子。PI3K不但参与调节早期A型流感病毒进入细胞的过程,而且它的激活还将导致感染后期细胞凋亡被抑制,后者功能的实现则依赖于流感病毒非结构蛋白NS1的表达。已被证实,PI3K调节亚基P85β与NS1蛋白的直接相互作用能导致PI3K的激活,参与次相互作用的位点是NS1蛋白的效应区以及P85β蛋白的iSH2和SH3区域。但是,NS1结合P85β蛋白导致PI3K被激活的具体机制尚不清楚,因此,如果可以得到NS1与P85β蛋白的复合物晶体结构,从而在三维空间结构上定位出蛋白间相互作用的关键氨基酸,并解释这种相互作用所导致的PI3K激活机制是一种潜在的行之有效的方法。在本文的实验中,我们克隆并表达H5N1株NS1效应区蛋白以及P85βiSH2和SH3区域的蛋白,重复验证这些区域的相互作用,结果表明只有P85β的iSH2区域跟NS1效应区存在直接的相互作用,而P85β的SH3区域并不与NS1效应区蛋白相结合。在证明这种相互作用没有亚型的特异性后,我们用各种生化方法纯化出NS1和P85β蛋白及其蛋白复合物,并用坐滴结晶的方法筛选并优化结晶条件,优化结晶条件的工作还在继续进行中。

目录

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1 前言

1.1 磷脂酰肌醇-3激酶家族简介

1.1.1 PI3K家族成员

1.1.2 PI3K信号通路

1.1.3 PI3K的生物学功能

1.2 A型流感病毒非结构蛋白NS1简介

1.2.1 禽流感病毒的分子结构

1.2.2 NS1蛋白的分群及进化分析

1.2.3 NS1基因及蛋白结构

1.2.4 NS1蛋白的功能

1.3 A型流感病毒非结构蛋白NS1与PI3K相互作用研究

1.3.1 A型流感病毒感染的细胞中PI3K的激活以及功能研究

1.3.2 A型流感病毒NS1蛋白激活PI3K的研究-相互作用及活性相关的基元和结构域的确定

1.4 立题背景

2 材料和方法

2.1 常用药品和试剂

2.2 DNA相关实验方法

2.2.1 基因序列

2.2.2 质粒载体

2.2.3 大肠杆菌(Escherichia coli)感受态细胞的制备和DNA转化

2.2.4 质粒DNA的提取

2.2.5 质粒DNA的工具酶处理

2.2.6 纯化DNA片段

2.2.7 DNA连接反应

2.2.8 PCR相关实验

2.3 蛋白质相关实验方法

2.3.1 亲和层析纯化

2.3.2 Bradford法测蛋白浓度

2.3.3 GST-pull down assay

2.3.4 蛋白质的SDS-PAGE电泳与Western blot分析

2.4 晶体相关试验方法

2.4.1 坐滴结晶法

3 实验结果

3.1 P85β和NS1质粒的构建及诱导表达

3.1.1 P85β质粒构建及诱导表达

3.1.2 NS1质粒构建及诱导表达

3.2 P85β和NS1相互作用区域的确定

3.2.1 GST pull down assay验证相互作用区域

3.2.2 相互作用没有流感病毒NS1蛋白的亚型特异性

3.3 P85β蛋白和NS1蛋白的结合比例

3.4 P85β-iSH2蛋白和NS1-ED(效应区)蛋白以及其复合物的纯化

3.4.1 NS1-ED(效应区)和P85β-iSH2蛋白的单独纯化

3.4.2 P85β-iSH2+NS1-ED(效应区)蛋白复合物的一步纯化

3.5 增加P85β-iSH2蛋白溶解性的策略

3.5.1 更换表达载体

3.5.2 突变P85β-iSH2疏水氨基酸

3.5.3 使用各种化学试剂

3.6 P85β-iSH2+NS1-ED(效应区)蛋白复合物结晶条件筛选

4 结果讨论

附录一:结晶筛选结果统计表

附录二:图表索引

参考文献

致谢