云纹石斑鱼与褐石斑鱼的比较研究

摘要

本文从形态、细胞和分子水平对分类上存在混淆的云纹石斑鱼(Epinephelus moara)和褐石斑鱼(E. bruneus)进行了比较研究，以澄清它们在分类上的疑问、弄清其遗传背景并筛选可以鉴别两者的特异性分子标记，为云纹石斑鱼和褐石斑鱼的理论研究、生产实践及种质资源的保护提供重要资料。主要结果如下： 1.2种石斑鱼的体形和体表横带等外部形态特征非常相似，但体表斑纹不同，Fisher逐步判别法表明两者在背鳍鳍条、鳃耙和幽门盲囊等方面差异达到极显著水平(p<0.001)。两者骨骼系统均由脑颅、咽颅、脊柱、肋骨和附肢骨骼组成，主轴和附肢骨骼的形态结构基本相同，但在脑颅的眶前骨和眶后骨、咽颅的前鳃盖骨和尾舌骨、附肢骨骼的髓棘间骨及尾下骨与尾鳍鳍棘连接方式等方面存在差异，骨骼差异可作为属间或种间的分类依据。结果确认云纹石斑鱼和褐石斑鱼为为形态特征可以鉴别的2种石斑鱼。 2.利用常规核型、Ag-NORs、C-带、重复序列(5S rDNA、18S rDNA和(TTAGGG)n)的荧光原位杂交技术分析了2种石斑鱼的细胞遗传学特性： 2种石斑鱼二倍体染色体数目均为48，但单臂染色体和双臂染色体个数不同，因此核型不同：云纹石斑鱼为2n=48，4SM+44T(NF=52)；褐石斑鱼为2n=48，2M+4SM+42T(NF=54)。银染和FISH均显示，云纹石斑鱼和褐石斑鱼中期分裂相中NORs的数目不同。Ag-NORs主要为4个和5个，分别位于2对(第9和24)和3对(第2、9和24)双臂染色体短臂或亚着丝粒区，种内Ag-NORs数目和分布模式均具多态性；2种石斑鱼18S rDNA的FISH杂交信号分别为4个和6个，位于双臂染色体亚着丝粒区，不同染色体对杂交信号强弱不同。2种石斑鱼均有1对5S rDNA杂交信号位于1对中等大小端部着丝粒染色体亚着丝粒位置。 2种石斑鱼大多数染色体均具有着丝粒C-带，有些同时还具有端粒C-带；云纹石斑鱼第9对染色体和褐石斑鱼第2对染色体短臂相应的Ag-NORs区均具有恒定异染色质C-带。2种石斑鱼大多数染色体着丝粒位置及部分染色体近端粒区呈DAPI阳性带，与C-带结果一致。2种石斑鱼均仅在染色体的端粒位置而没有在中间部位检测到端粒序列(TTAGGG)n探针杂交信号，云纹石斑鱼信号强度及大小比较均匀，而褐石斑鱼染色体组有10对端部着丝粒染色体末端的端粒序列杂交信号强度和大小均明显强于其它染色体上的杂交信号(约4倍以上)。结果显示2种石斑鱼具有较近的亲缘关系，为石斑鱼属中的特化类群，在进化上云纹石斑鱼比褐石斑鱼更原始。 3.采用AFLP、RAPD及ISSR分子标记分析了2种石斑鱼遗传多样性。10对AFLP引物、30个RAPD引物和21个ISSR引物分别产生997、226和148条扩增片段，多态位点百分比分别为36.31％、34.51％和27.03％；种间分化明显，平均遗传距离D分别为0.2987、0.3178和0.1792，Shannon's信息指数I分别为0.2247、0.2251和0.1753，遗传分化系数Gst分别为0.7997、0.8298和0.6460；种内遗传多样性水平均不高，遗传相似度S分别为0.9632和0.9630、0.9775和0.9691、0.9414和0.9769。mtDNA的16S rRNA、Cytb和ND2基因及核基因组中核糖体基因簇的ITS1区进化分析均表明：石斑鱼属是石斑鱼亚科中最新演化的类群，云纹石斑鱼和褐石斑鱼为石斑鱼属内的近缘种。 将物种特异性的ISSR及RAPD标记转化并获得4个能鉴别2种石斑鱼的稳定SCAR标记。选取ND2基因和ITS1区为目的片段，首次成功地通过改良建立的Nest-Tetra-primer specific PCR方法对2种石斑鱼进行鉴别，分别获得3个和5个可以鉴别2种石斑鱼特异性分子标记，为2种石斑鱼的鉴别提供了稳定、可靠、快捷的特异性分子标记技术，也为鱼类近缘种的DNA鉴别提供了新的途径。此外，验证实验进一步说明福建南部水域的这2种石斑鱼是具有不同的生态位，没发现杂交现象。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略语中英文对照

声明

第一章绪言

1鱼类种质资源概况

1.1鱼类种质资源研究进展

1.2鱼类系统分类研究现状

1.3石斑鱼简介

1.4石斑鱼种质资源研究现状

1.5石斑鱼系统分类研究

2研究对象介绍

2.1云纹石斑鱼简介

2.2褐石斑鱼简介

3本研究的技术路线、目的和意义

3.1技术路线

3.2目的和意义

第二章 云纹石斑鱼与褐石斑鱼的形态比较

1材料

1.1样品的采集与鉴定

1.2主要仪器

1.3主要试剂

1.4常用溶液配制

2方法

2.1形态特征计量

2.2骨骼系统解剖

3结果

3.1形态学特征

3.2骨骼系统特点

4讨论

4.1形态学特征及骨骼系统在鱼类研究中的应用

4.2云纹石斑鱼与褐石斑鱼形态特征分析

4.3云纹石斑鱼与褐石斑鱼骨骼系统比较

第三章 云纹石斑鱼与褐石斑鱼细胞遗传学研究

1材料

1.1样品的采集与鉴定

1.2主要仪器

1.3主要试剂

1.4常用溶液配制

2方法

2.1染色体核型研究

2.2重复序列FISH定位

3结果

3.1核型研究

3.2荧光原位杂交(FISH)

4讨论

4.1云纹石斑鱼与褐石斑鱼核型比较

4.2云纹石斑鱼与褐石斑鱼Ag-NORs分析

4.3云纹石斑鱼与褐石斑鱼异染色质C-带

4.4云纹石斑鱼与褐石斑鱼DAPI荧光带

4.5云纹石斑鱼与褐石斑鱼核糖体基因比较

4.6云纹石斑鱼与褐石斑鱼端粒探针分析

第四章 云纹石斑鱼与褐石斑鱼遗传背景检测及特异性分子标记的研究

1材料

1.1样品的采集与鉴定

1.2主要仪器

1.3主要试剂

1.4常用溶液配制

2方法

2.1遗传背景检测

2.2特异性分子标记的筛选

3结果

3.1遗传背景检测

3.2特异性分子标记筛选

4讨论

4.1 3种分子标记对云纹石斑鱼和褐石斑鱼遗传多样性的分析

4.2云纹石斑鱼和褐石斑鱼进化地位和亲缘关系探讨

4.3特异性分子标记对云纹石斑鱼和褐石斑鱼的鉴别

结语

附录

参考文献

在学期间研究成果

致谢