深海细菌Shewanella piezotolerans WP3铁离子调控因子—Fur调控蛋白功能研究

摘要

深海是一个特殊的生态环境，这里不仅低温、高压、黑暗、寡营养，而且氧气浓度也较低。深海特殊的生态环境造就了生活在该环境下生物的特异生理代谢特性，研究该生态系统下的微生物的生理特性，对于了解极端微生物的生活特性，极端微生物资源的开发利用具有重要的意义。 本文所研究的细菌Shewanella piezotolerans WP3为一株分离自西太平洋1914米深海沉积物中的一株革兰氏阴性菌。WP3为一杆状的兼性厌氧菌，属于r-proteobacterium，具有55个编码细胞色素C的基因，比Shewanella oneidensisMR-1(42个编码细胞色素C基因)多13个。在有氧培养条件下，WP3的菌体呈现淡紫色，同时逆转录PCR实验的结果也表明这些细胞色素C在有氧条件下也具有一定程度的转录。这个结果表明即使在有氧条件下，WP3的厌氧呼吸途径也在起作用并为其提供生命活动所必须的能量来源。这些细胞色素C很可能对WP3适应低氧气浓度这一深海特异的生长环境因子具有重要的生理学意义。如何维持好细胞内的Fe离子浓度的平衡对于所有的细菌均具有重要的生理意义：一方面，生命活动离不开铁离子。铁离子是一些功能蛋白的结构组成成分，如异柠檬酸脱氢酶亚基中的Fe-S结构域，它还是细胞内重要代谢的催化因子如DNA代谢，TCA循环，糖酵解等都离不开铁离子的参与；另一方面，铁离子尤其是还原态的二价铁离子浓度过高容易通过Feton Reaction导致细胞的氧化损伤。WP3的特意的生理特性及其所生活的环境决定了研究WP3中Fur如何调控细胞内铁离子水平更具重要意义。一方面，WP3相对于普通细菌，需要更多的铁离子。WP3所具有的特异的厌氧呼吸途径上的大量细胞色素C的成熟需要大量的铁离子的参与，不仅如此WP3能够以Fe3+作为最终电子受体进行厌氧呼吸。另一方面，WP3所处的原生活环境中可直接利用的铁离子浓度低，铁离子一般以固态化合物形式大量存在于深海沉积物中而非海水中。与铁离子的存在形式相反，硫酸盐在深海环境中的浓度高。所以深海是一个低可溶性铁离子高硫酸盐的特异生理环境。Fur是存在于大部分细菌中的调控细胞内Fe离子浓度平衡的一个调控因子，具有多样的调控方式对目的基因的转录进行调控。同样在WP3基因组中，我们也找到了一个fur基因。为了研究WP3的铁离子平衡调控，我们构建了一株fur基因缺失突变的WP3，简称Fur。通过基因芯片研究我们发现在WP3中该基因具有重要生理作用，该基因的删除导致了大量基因的差异表达。Fur的基因芯片结果与低Fe离子浓度培养的基因芯片结果对比发现：虽然这两个芯片实验的数据中差异表达的基因中与铁离子转运相关的基因表达方向具有较好的一致性，证明Fur在WP3中主要起调控细胞内铁离子平衡的作用。但是还有大量的基因在这两组数据中表达的方向相反，表明fur的缺失突变与缺铁培养所造成WP3的生理状态具有较大的差异。通过分析，我们发现很可能是细胞内Fe2+浓度的不一样造成。与其他菌株的Fur调控因子缺失突变结果相似，H2O2的耐受性实验中Fur存活率大大低于野生WP3，表明了Fur细胞内过高Fe2+浓度导致更加剧烈的FetonReaction反应进而杀伤细胞。通过检测细胞内的Fe2+浓度，我们发现fur的缺失突变的确导致细胞内Fe2+水平的上升。 本研究通过检测fur突变株的厌氧代谢生长状况发现fur的删除突变造成厌氧呼吸速率受到影响。这是首次发现fur的删除突变会影响到希瓦氏属细菌的厌氧呼吸速率。通过基因芯片数据的分析，发现这很可能是由于血红素合成途径，及细胞色素C成熟途径上的基因下调。我们比较了fur突变株与野生WP3厌氧条件下的细胞色素C，发现所有的细胞色素C的含量在fur突变株中均低于野生WP3而不是单个或某些细胞色素C的低表达所致。通过在以血红素为添加剂的Fur培养及ccmC的删除突变，证实细胞成熟途径上基因的下调很可能就是导致Fur厌氧呼吸能力削弱的主要原因。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩写词表

声明

1 前言

1.1深海微生物研究概况

1.1.1深海环境的特点

1.1.2深海微生物研究的历程

1.1.3深海微生物研究的意义和迫切性

1.2基因芯片研究进展

1.2.1基因芯片发展过程

1.2.2基因芯片面临的挑战

1.3细胞内铁离子调控因子及研究WP3的铁离子调控因子的意义

1.3.1铁离子调控因子介绍

1.3.2研究深海耐压菌WP3中铁离子调控因子-Fur的意义

2材料与方法

2.1材料

2.1.1菌株与质粒

2.1.2引物

2.1.3主要仪器

2.1.4工具软件

2.1.5主要试剂

2.1.6工具酶

2.1.7试剂盒

2.1.8常用溶液、培养基的配制

2.2方法

2.2.1不同条件下的细菌培养

2.2.2细菌总DNA的提取

2.2.3 WP3总RNA的提取

2.2.4.基因组DNA的去除及RNA的纯化

2.2.5 DNA乙醇沉淀

2.2.6 PCR反应

2.2.7菌落PCR

2.2.8琼脂糖凝胶上DNA片段的回收

2.2.9 PCR产物的回收

2.2.10核酸内切酶酶切反应

2.2.11质粒去磷酸化处理

2.2.12连接反应

2.2.13化学感受态细胞的制备

2.2.14质粒的化学转化

2.2.15质粒提取

2.2.16同源性比对

2.2.17反转录PCR(RT-PCR)

2.2.1 8 Real time PCR

2.2.19缺失突变载体和突变菌株的构建(双亲杂交)

2.2.20基因芯片扫描及分析

2.2.21 Fur box的生物信息学预测

2.2.22 Fe2+浓度检测

2.2.23细菌H2O2耐受性实验

2.2.24细胞色素C检测

3结果与分析

3.1 Fur基因删除突变株的构建

3.2 Fur删除突变导致厌氧呼吸能力受到抑制

3.3 Fur菌株在不同铁离子浓度条件下的生长速率与WP3野生菌株有很大的差异

3.4 Fur删除突变导致H2O2耐受性下降

3.5 Fur突变/WP3野生菌株和WP3缺铁培养/WP3富铁培养基因芯片结果分析

3.5.1 RNA提取及质量检测

3.5.2芯片杂交及扫描

3.5.3荧光定量PCR验证基因芯片数据可靠性

3.5.4基因芯片数据分析

3.6 Fur box的生物信息学预测

3.7 Fur删除突变株厌氧能力受抑制原因分析及生理生化验证验证

3.8 Fur删除突变导致细胞内Fe2+浓度上升

3.9硫酸盐同化作用合成半胱氨酸对WP3适应低铁环境具有重要意义

3.10 Fur以不同方式调控两个相邻基因FeoAB基因与omcAB基因

3.11 Fur全局性调控总结

4结论与展望

4.1结论

4.2展望

参考文献

附录

致谢