对虾白斑综合症病毒(WSSV)膜蛋白VP13A的鉴定及VP31和VP33与宿主细胞相互作用的初步研究

摘要

对虾白斑综合症病毒是一种具有囊膜、无包涵体的杆状双链环状DNA病毒，也是严重危害对虾养殖业的最主要病原。本文围绕病毒膜蛋白进行了研究。主要包括以下三个部分： (1)质谱分析发现病毒膜蛋白VP13A是ORF wsv284的编码产物。随后在E.coli BL-21菌株中表达纯化了GST-VP13A-His并制备了相应的抗血清。利用GST pull-down和Far-Westernblotting分析发现VP13A和另一个病毒膜蛋白VP24有相互作用。 (2) WSSV的膜蛋白VP31和VP33都具有RGD序列，推测该结构域在这两种蛋白和宿主细胞的结合中起重要作用。分别可溶表达并纯化得到这两种全长蛋白以及RGD序列被RDG所替代的突变蛋白。间接免疫荧光染色和RGD竞争抑制实验显示，只有野生型蛋白能结合螯虾血细胞，而这种结合又能被含RGD序列的多肽抑制，证实了VP31和VP33对宿主细胞的粘附是由RGD结构域所介导的。 (3)病毒具有自我组装的机制，一般是由ATP酶起作用，推测wssv也有自身编码的ATP酶。利用试剂盒检测纯化的wssv病毒粒子，发现具有微弱的ATP酶活性。以蔗糖密度梯度离心有效地分离了不同包装程度的病毒粒子，为今后研究病毒结构、装配和成熟机制提供了一些新思路。

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英文文摘

论文说明：缩略词

声明

前言

1对虾白斑综合症病毒(WSSV)及其分子生物学研究

1.1对虾白斑综合症病毒的研究概况

1.2对虾白斑综合症病毒的基因组学研究

1.3对虾白斑综合症病毒的蛋白质组学研究

2本论文研究的内容和意义

第一部分对虾白斑综合症病毒膜蛋白VP13A基因的鉴定

1前言

2材料与方法

2.1材料

2.2方法

3结果

3.1 VP13A的基因结构和氨基酸信息

3.2 VP13A基因的克隆表达和可溶蛋白纯化

3.3 Western blot分析

3.4 VP13A与WSSV膜蛋白之间的相互作用

4讨论

第二部分对虾白斑综合症病毒膜蛋白VP31及VP33对宿主细胞的粘附研究

1前言

2材料与方法

2.1材料

2.2方法

3结果

3.1 VP31及VP33突变蛋白的设计

3.2 MBP-VP31-His和MBP-VP31m-His的诱导表达和纯化

3.3 VP33m-His的诱导表达和纯化

3.4细胞结合活性分析

4讨论

第三部分对虾白斑综合症病毒ATP酶活性的初步研究

1前言

2材料与方法

2.1材料

2.2方法

3结果

3.1 WSSV全病毒的ATP酶活性初步测定

3.2经蔗糖密度梯度离心分离的病毒区带的电镜观察和SDS-PAGE分析

3.3 WSSV膜蛋白组分中ATP结合蛋白的SDS-PAGE分析

4讨论

参考文献

附录 主要仪器设备、常规溶液配制和常规实验方法

致谢