超高灵敏流式检测仪的多方位改进及其在化学生物学研究中的应用

摘要

流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)是一种对单个细胞或细胞大小的颗粒进行快速定量分析和分选的先进技术。然而,传统的流式细胞仪难以检测粒径小于0.5微米或者亮度少于几百个荧光素分子的颗粒。自然界中存在着众多的生物纳米颗粒,如细菌、病毒、线粒体、分子组装体、生物大分子等,它们的尺寸均在纳米至亚微米范围。此外,随着纳米技术的飞速发展,纳米颗粒(如纳米金、量子点、磁性纳米颗粒、纳米乳胶微球等)被广泛地应用于标记、运载、治疗、传感、分离以及纯化等生物技术领域。纳米颗粒以及纳米生物的单个分析可揭示因集权平均而被掩盖的个体差异,获得颗粒的性状分布图,考察个体对于整体的贡献。因此,发展先进的单个纳米颗粒分析技术,快速、灵敏地对纳米颗粒的尺寸、浓度及生化特性等进行同时表征,对于化学生物学研究具有重要意义。本论文以本人硕士阶段搭建的单荧光通道超高灵敏流式检测仪(High sensitivity flowcyotmter,HSFCM)为基础,通过多方位的仪器改进,应用于化学生物学研究的不同检测体系。
　　 本论文主要包括以下几个方面的内容:
　　 第一章为文献综述。主要介绍流式细胞术的概念、历史、新型流式细胞技术的发展以及在微生物学中的应用。在本章最后部分介绍本论文的选题思路以及研究内容。
　　 第二章为HSFCM应用于单个纳米颗粒的检测。将单荧光通道HSFCM改进为侧向散射光和橙色荧光信号同时检测的双通道HSFCM:采用532 nm激光器作为光源且功率控制在0.75 mW,侧向散射光和橙色荧光信号分别由光电倍增管(PMT)和单光子计数检测器(APD)检测。HSFCM的荧光通道可以实现单个藻红蛋白荧光信号的检测,信噪比约为17。散射光通道可以明确地检出直径为100 nm的单个聚苯乙烯纳米球,且对不同大小的聚苯乙烯纳米粒子具有优良的分辨率。使用双通道HSFCM对210 nm荧光纳米颗粒进行无标样的绝对计数,定量检测得到的浓度与厂家的报告浓度具有良好的相关性(R2>0.99),而且在所测浓度范围内(1.62x105～3.93×107particles／mL)检测效率达90％。对含有不同比例的荧光纳米颗粒和非荧光纳米颗粒的混合物进行检测,取得了与理论值非常一致的结果。此外,对携载阿霉素的370 nm ZrO2纳米颗粒和荧光染色的细菌E.coli ER2738的检测表明双通道HSFCM可应用于不同材料纳米粒子的分析。
　　 第三章为HSFCM应用于致病菌与总菌数目的同时检测。为实现致病菌与总菌数的同时检测与定量分析,将HSFCM改进为双荧光检测通道:采用488 nm激光器作为光源且功率控制在1.0 mW,更换二向色滤光片和带通滤光片将检测通道改进为绿色荧光和红色荧光双通道,且荧光信号分别由两个单光子计数检测器(APD)检测。以致病菌E.coli O157:H7和非致病菌E.coli DH5α作为检测模型,优化了荧光探针的选择及染色方案,建立了细菌的核酸染色检测体系和致病菌的单克隆抗体-生物素-亲和素级联放大检测体系。对抗体单染或抗体与核酸共染的致病菌E.coli O157:H7以及双染的非致病菌E.coli DH5α分别进行检测与定量,计数结果与传统的平板计数法均具有很好的一致性,检测限约为105cells／mL。对于含有不同配比E.coli O157:H7和E.coli DH5α的细菌混合样品的检测也取得了与理论值非常一致的结果。将抗体与核酸共染的双荧光法应用于天然矿泉水中致病菌的检测,结合离心富集法可使检测限降低到102 cells／mL。实验结果表明HSFCM在致病菌的快速鉴定与定量分析方面具有巨大的应用潜力。
　　 第四章为HSFCM应用于单细菌水平低丰度β-半乳糖苷酶的检测。为利用荧光底物FDG实现对单个细菌中低表达β-半乳糖苷酶的检测,将HSFCM改进为侧向散射光和绿色荧光同时检测的双通道:采用488 nm激光器作为光源且功率控制在1.0 mW,侧向散射光和绿色荧光信号分别由光电倍增管(PMT)和单光子计数检测器(APD)检测。以转化了质粒pUC18的大肠杆菌E.coli JM109为检测模型；在没有诱导剂条件下,由于存在大量阻遏蛋白而使得重组E.coliJM109表达低拷贝的β-半乳糖苷酶。利用FDG对细菌中低水平表达的β-半乳糖苷酶染色,通过优化染色条件,在HSFCM上获得了较好的绿色荧光信号。结合MUG定量法确定了单个重组E.coli JM109细菌在没有诱导剂存在的情况下β-半乳糖苷酶的本底表达拷贝数在92～179之间。
　　 第五章为HSFCM应用于单细菌水平自发荧光的检测与定量。为保证较宽的信号检测动态范围以及灵敏度的可调性,HSFCM的侧向散射光和绿色荧光检测通道的检测器均更换为线性范围较宽的PMT；为了提高对弱荧光信号的检测,将488 nm激发光源的功率提高到4.5 mW。通过与不同大小聚苯乙烯纳米颗粒的信号比较以及连二亚硫酸钠的细菌自发荧光淬灭实验(核黄素及其衍生物FAD和FMN的可逆氧化-还原性),证实HSFCM可明确地检测到单个细菌的自发荧光信号,而且这些荧光信号主要来源于细菌中氧化型的黄素类物质。利用三种FITC当量已知的商品化荧光纳米颗粒绘制FITC当量与信号强度的标准工作曲线,对8种细菌的自发荧光分别进行了定量分析。此外,通过不同生长时期的细菌自发荧光的变化证明了FAD和FMN等核黄素类物质的含量和氧化还原状态与细菌代谢以及生长状态密切相关。
　　 第六章为HSFCM应用于单细菌水平EGFP基因表达的快速监测。采用侧向散射光和绿色荧光双通道的HSFCM对E.coli BL21(DE3)／pET-32a(+)-EGFP和E.coli BL21(DE3)pLysS／pET-32a(+)-EGFP两种体系中不同调控条件下的EGFP融合蛋白的表达进行快速监测。与耗时长且操作繁琐的SDS-PAGE检测法相比,HSFCM可以明显检测到E.coli BL21(DE3)／pET-32a(+)-EGFP体系中本底表达的EGFP融合蛋白以及较严谨E.coli BL21(DE3)pLysS／pET-32a(+)-EGFP体系中低IPTG诱导下低表达水平的EGFP融合蛋白。此外,HSFCM还可以对不同浓度IPTG诱导下的EGFP表达量以及不同生长时间点下的EGFP表达量进行快速检测。
　　 第七章为总结与展望。总结了本论文的研究内容,并对将来进一步的研究工作进行了展望。