蛋白激酶A抑制剂的设计、合成以及在其他方面的应用

摘要

催化蛋白的可逆磷酸化,调节着细胞信号转导、细胞分化和细胞生长等几乎所有的生命活动过程,是一种普遍的重要调节机制。蛋白质在蛋白激酶作用下发生磷酸化,在磷酸酶的作用下去磷酸化。在人类中,己发现有518种蛋白激酶。蛋白激酶A(PKA)作为第一个最早被解析的激酶晶体,由于其结构及性质比较清楚,已经成为人们研究蛋白激酶家族的最佳切入点。本文主要致力于蛋白激酶A含磷抑制剂的设计,合成,并以蛋白激酶A为模板,对我们提出的蛋白激酶磷酰基转移“排球”机理进行初步的理论研究,最后对合成的系列化合物做了拓展应用研究。
　　 我们建立了基于Autodock以及Dock对接的蛋白激酶A抑制剂的虚拟筛选平台,并用于抑制剂的筛选与全新设计。以1991-2008年35个蛋白激酶A抑制剂的晶体复合物及实验抑制率常数为训练集,对虚拟对接参数进行优化,并建立了筛选条件的标准:最低结合能低于-7.5 keal mol-1,范德华力,氢键,去溶剂化能之和的能量值低于-9.0kcal mol-1的化合物分子才有可能对蛋白激酶Aa亚型具有低于50 nM的抑制活性。以此条件,本文对美国国家癌症研究所(National Cancer Institute,NCI)的小分子化合物库进行虚拟筛选,并结合Dock刚性对接的结果进行交叉筛选,得到8个排名最前的化合物分子。此外,我们参考蛋白激酶A抑制剂H89系列化合物的结构,以稳定磷碳键药效团模式引入ATP结合口袋的三磷酸区域的创新性思想,设计并多步骤合成了一系列的含磷有机磺酰胺化合物8a-8j,运用基于γ-PO4-18O-ATP稳定同位素质谱技术进行活性测试表明:该系列化合物对蛋白激酶A抑制活性不明显。
　　 鉴于本实验室长期从事磷酰化氨基酸功能和性质的研究,我们结合蛋白激酶A磷酰基转移的立体化学过程,提出了一种新颖的磷酰基转移三步共价“排球”机理,并对该机理进行初步的理论研究。用Gaussian程序优化活性口袋的92个原子模型可能经过的五步中间体,进行结构与能量分析发现:其中γ-PO3-NH2-Lys168的P-N中间体的能量约为11 kcal mol-1,揭示了Lysl68进攻ATP的γ磷酸根的合理性。而五配位磷混酐的中间体普遍能量都比较高(最低能量达31.7 kcal mol-1),因此,它可能直接是一个过渡态的结构,而非中间体。在此过程中,还出现了Mg2+离子配位的大幅度不合理变化,所以有必要对我们提出的“排球”机理做出合理的修正。
　　 此外,我们还对合成的含磷手性脯氨酸7,进行了不对称催化环己酮与硝基烯的Michael加成的方法学研究。结果表明:此类催化剂能在常温常压下,并且在低的负载量(5 mol％)上,达到较高的区域选择性跟立体选择性(高达99:1 dr和96％ee)。同时我们对此机理展开理论模拟,发现引入的手性羟基对硝基的氢键诱导是Michael加成立体选择性的来源,而产物的配分比由过渡态anti-SRts的最低能垒(4.9 kcal mol-1)决定,这与我们的实验结果相符合。
　　 最后,我们对含有不同取代基的系列化合物6a-6f,展开系统的电喷雾质谱裂解规律研究,在磷碳键断裂的过程中,发现伴随着一个新颖的五元环的质子迁移机理。我们用稳定同位素氘代实验结合离子回旋共振高分辨质谱证明了裂解的途径的正确性,并结合量子化学计算对裂解途径进行模拟,计算结果表明:该裂解途径是一个能量不利的非自发的过程(⊿E6c=22.4 kcal mol-1),刚好与该系列化合物的合成途径相反。
　　 总之,本论文建立起一个基于高通量虚拟筛选的平台,并以蛋白激酶A的靶点进行筛选,以稳定磷碳键药效团模式引入ATP结合口袋的三磷酸区域的创新性思想,设计并多步骤合成了一系列的含磷有机磺酰胺化合物的潜在抑制剂,最后还对它们在不对称催化以及质谱裂解规律方面进行拓展性研究。