载尼古丁微球预防AD及尼古丁预防AD机制的实验研究

摘要

目前，对于阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)一直没有有效的治疗手段，只能通过药物缓解病情。实验和临床结果表明，尼古丁可以预防并治疗AD。但是，由于尼古丁防治AD的机制和疗效研究还不够深入，并且尼古丁具有半衰期短、毒副作用大等缺点，很难推广应用。载药缓释微球具有缓慢控制药物释放的特点，因此，本文首次制备了载尼古丁缓释微球并将其用于进行预防AD的探索，并进行了尼古丁预防AD相关分子机制的实验研究。
　　首先，选择聚乳酸(Polylactic acid，PLA)为药物载体材料，以尼古丁为模型药物，采用复乳法和喷雾干燥法制备载药尼古丁微球;对载药微球的载药量和包封率进行了测定;对微球的形貌、粒径进行了表征;对载药微球的体外药物释放行为进行了研究。结果表明，复乳法制备的载药微球粒径主要介于2～20μm之间，平均粒径为3.75μm，表面光滑、中空;而喷雾干燥法制备的载药微球粒径主要介于500nm～10μm之间，平均粒径为2.45μm，微球表面不光滑，出现皱褶，未见中空;复乳法制备的载药微球包封率和载药量为54.00％和5.40％;而喷雾干燥法制备的载药微球包封率和载药量为34.50％和1.78％;复乳法制备的载药微球突释现象不明显，而喷雾干燥法制备的载药微球突释现象明显。复乳法制备的载药微球形貌、粒径分布、载药量、包封率及载药微球的体外释放行为均优于喷雾干燥法制备的载药微球。因此，本研究选择了复乳法制备的尼古丁载药微球。
　　其次，利用包载尼古丁的载药微球对AD实验小鼠的预防效果进行了研究。通过水迷宫定位航行实验和空间探索实验，观察载尼古丁微球以及尼古丁对AD小鼠认知和记忆能力改善的程度;通过脑组织切片的HE染色，观察载尼古丁微球和尼古丁对AD小鼠海马神经元凋亡或死亡的保护作用;通过脑组织切片的刚果红染色，观察载尼古丁微球和尼古丁对AD小鼠降低老年斑(Senile plaque，SP)在脑组织中形成情况。结果显示，在水迷宫定位航行的寻找平台潜伏期实验中，空白组、尼古丁微球组、尼古丁组与模型组之间均具有显著性差异(p＜0.05)，但是空白组、尼古丁微球组、尼古丁组之间均无显著性差异，表明本实验AD模型造模成功，并且尼古丁微球组和尼古丁组小鼠在寻找平台的潜伏期方面表现出与空白组小鼠水平接近，载尼古丁微球和尼古丁都能改善AD小鼠的认知和记忆功能。在水迷宫的空间探索穿越平台次数实验中，空白组与模型组之间具有高度显著性差异(p＜0.01);尼古丁微球组、尼古丁组与模型组之间均具有显著性差异(p＜0.05)，尼古丁微球组与尼古丁组之间虽然没有显著性差异，但是尼古丁组与空白组之间有显著性差异(p＜0.05)，而尼古丁微球组与空白组之间没有显著性差异。结果表明本实验AD模型造模成功，并且尼古丁微球组优于尼古丁组，载尼古丁微球能更好的发挥改善认知和记忆能力。载尼古丁微球与尼古丁相比更能减少海马各区神经元的凋亡或死亡、增加海马各区正常功能神经元的数量、减少SP在脑组织中的形成、提高预防效果。载尼古丁微球在体内能够长效、缓慢释放尼古丁，只需一周给药一次，连续二周给药;而尼古丁在体内半衰期短只有二个小时，需每天二次注射，连续二周给药。本实验表明载尼古丁微球优于尼古丁，具有减少给药次数、较长时间保持尼古丁浓度、维持尼古丁水平平稳，更好发挥增强改善认知和记忆能力，减轻大剂量尼古丁对神经元造成的损害，减少海马神经元的凋亡或死亡、增加海马神经元的数量、减少SP在脑组织中的形成，减缓实验性小鼠AD的发病进程，但并不能完全阻止该病的发生。
　　最后，对尼古丁预防AD的相关分子机制进行了研究。应用蛋白印迹分析、流式细胞术分析、实时定量聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR)、噻唑蓝方法(Method3-(4，5-Dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazolium，MTT)和免疫组化方法观察尼古丁在神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞中对即刻早期转录因子(Early growth response protein1，Egr-1)的表达情况、尼古丁介导的Egr-1基因上调与磷酸化细胞外信号调节蛋白激酶1/2(Phosphorylation Extracellularsignal-regulated kinase1/2，pERK1/2)水平的相关性、SH-SY5Y细胞系中在转录水平尼古丁乙酰胆碱受体α7的干扰效果、小鼠海马区和大脑皮质pERK1/2和EGR-1的表达量、尼古丁对淀粉样蛋白Aβ25-35毒性的拮抗作用。结果表明，10-6mol/L的尼古丁可以促进即刻早期生长因子Egr-1基因在转录水平的增强，促进EGR-1蛋白的转录翻译;尼古丁处理组EGR-1蛋白表达量上调;丝裂原原活化蛋白激酶(Mitogen activated protein kinase，MAPK)/细胞外信号调节蛋白激酶(Extracellular signal-regulated kinase，ERK)信号通路关键蛋白细胞外信号调节蛋白激酶1/2(Extracellular signal-regulated kinase1/2，ERK1/2)的磷酸化水平与EGR-1蛋白的表达量呈正相关，尼古丁能够通过MAPK/ERK信号通路激活Egr-1基因;在SH-SY5Y细胞系中验证了尼古丁乙酰胆碱受体α7转录水平的干扰效果，尼古丁通过尼古丁乙酰胆碱受体α7激活MAPK/ERK信号通路;在动物实验的小鼠大脑海马CA1、CA3、DG以及大脑Cortex区的不同处理组间pERK1/2和EGR-1蛋白表达量差异明显;尼古丁对淀粉样蛋白Aβ25-35的神经毒性具有拮抗作用。结果证明，Aβ25-35神经毒性可引起MAPK/ERK通路过度活化，而适当剂量的尼古丁可通过尼古丁乙酰胆碱受体α7抑制MAPK/ERK/EGR-1通路过度活化，从而降低Aβ25-35介导的神经毒性。

目录

声明

摘要

缩略语索引

第一章 前言

1．AD的病理学变化

2．AD的病因病机

2．1 遗传学因素

2．2 Aβ代谢异常

2．3 Tau蛋白过度磷酸化

2．4 线粒体形态改变及功能紊乱

2．5 氧化应激

2．6 雌激素

2．7 异常细胞周期重启

3．目前主要的治疗药物

3．1 胆碱酯酶抑制剂

3．2 谷氨酸受体阻断剂

3．3 自由基清除剂和抗氧化剂

3．4 雌激素

3．5 其他潜在应用药物

4．缓释控释制剂的发展

5．缓释制剂在中枢神经系统疾病中的应用

5．1 埋植剂在中枢神经系统疾病中的应用

5．2 缓释微球在中枢神经系统疾病中的应用

第二章 载尼古丁微球预防AD的实验研究

1．背景

2．载尼古丁微球的制备及表征

2．1 材料与方法

2．2 载尼古丁微球的制备及体外评价

2．3 结论

3．载尼古丁微球对实验性AD小鼠的影响

3．1 材料与方法

3．2 结果

3．3 讨论

3．4 结论

第三章 尼古丁预防AD机制的实验研究

1．背景

2．实验研究

2．1 材料和方法

2．2 结果

2．3 讨论

2．4 结论

全文总结

参考文献

致谢