稀有放线菌的抗耻垢分枝杆菌活性筛选及一株阳性菌株的初步研究

摘要

上世纪80年代以来，由于大量的结核耐药菌株(MDR-TB，XDR-TB，ADR-TB)的出现、艾滋病的流行等原因，使得结核病疫情再度上升，成为全球关注的重大公共卫生问题和社会问题。而目前临床上常用的抗结核一线药物仍为50多年前上市的利福平、异烟肼等，因此寻找抗结核分枝杆菌的新化合物仍然是制药领域的一个挑战。
　　天然产物是药物的重要来源，许多常用临床药物均来自于微生物尤其是放线菌的次级代谢产物，而近年来，由于链霉菌中大量的抗生素被重复发现，人们开始把研究重点转移到稀有放线菌上，以期获得新的药物。
　　本文以耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis）为指示菌，对本实验室分离的223株分别属于13个属的稀有放线菌进行活性初筛和8种培养基复筛，获得23株优势活性菌株及其活性培养基，其中拟诺卡氏菌属（Nocardiopsis）和马杜拉菌属(Actinomadura)放线菌的活性菌株数量最多，均占阳性菌株的25.0％;拟诺卡氏菌属（Nocardiopsis）、诺卡氏菌属（Nocardia）和链孢囊菌属（Streptosporangium）菌株的活性最好，分别占该属供测菌株的60.0％、50.0％和50.0％;燕麦固体培养基是大部分活性菌株的最佳培养基，固体发酵菌株的生长情况、产量和活性均比液体发酵好。
　　对23株优势活性菌株的发酵产物进行初步分离研究，追踪菌株的活性组分。通过对优势活性菌株发酵产物的各组分进行抗耻垢分枝杆菌实验，结果表明所检测的一半以上的样品对耻垢分枝杆菌具有抑制作用，其中100％甲醇洗脱组分、70％甲醇洗脱组分以及石油醚萃取组分的活性最好，说明优势活性菌株均能产生多种极性不同的抗耻垢分枝杆菌的化合物。
　　挑选出一株活性强的阳性菌株LZ95进行化学成分初步研究。通过16SrDNA序列分析，LZ95属于马杜拉菌属。对LZ95在燕麦培养基上的次生代谢产物进行分离以追踪其抗耻垢分枝杆菌的化合物。分离到3个化合物，Q J-1为二氢苯并吡喃酮衍生物5，7-dihydroxy-2-isopropylchromone，QJ-8为苯甲酸类化合物，QJ-12为糖苷类化合物。对这三个化合物进行抗耻垢分枝杆菌活性测定发现QJ-1和Q J-12有较弱的抑耻垢分枝杆菌活性。

目录

声明

摘要

常用英文缩写词

1 前言

1．1 抗结核药物研究进展

1．1．1 结核病的流行和防治现状

1．1．2 获取新药物途径的研究进展

1．1．3 抗结核药物研究开发的新方法

1．1．4 近年研究和开发的抗结核药物

1．2 稀有放线菌及其活性代谢产物的研究概况

1．2．1 稀有放线菌分类地位

1．2．2 稀有放线菌研究意义

1．2．3 稀有放线菌产生抗生素的研究

1．3 本课题的研究目的、内容、意义

2 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 菌株来源

2．1．2 常用培养基

2．1．3 常用试剂

2．1．4 主要试剂及耗材

2．1．5 主要仪器

2．2 方法

2．2．1 技术路线

2．2．2 稀有放线菌发酵方法

2．2．3 生物活性的测定

2．2．4 分子分类研究

2．2．5 天然产物的分离纯化

2．2．6 化合物的结构鉴定

3 结果与分析

3．1 活性菌株的初筛

3．2 活性菌株的复筛

3．2．1 活性菌株的固体培养基复筛

3．2．2 活性菌株的液体培养基复筛预实验

3．2．3 活性菌株的液体培养基复筛

3．3 优势活性菌株的1L发酵及活性组分分析

3．3．1 优势活性菌株固体发酵与发酵产物的处理

3．3．2 优势活性菌株发酵粗提物的反相硅胶(RP-18)层析

3．3．3 优势活性菌株发酵粗提物各组分的薄层层析(TLC)检测

3．3．4 优势活性菌株发酵粗提物各组分的抗肿瘤活性测定

3．4 海洋放线菌Actinomadura sp.LZ95的初步研究

3．4．1 LZ95菌株的16SrDNA序列分析

3．4．2 LZ95菌株系统发育树的构建

3．4．3 LZ95菌株的次生代谢产物研究

3．4．5 其他抗菌活性测定

3．4．6 抗肿瘤细胞活性测定

4 结论与讨论

4．1 稀有放线菌抗耻垢分枝杆菌活性初筛

4．2 活性菌株的复筛

4．2．1 活性菌株的固体培养基复筛

4．2．2 活性菌株的液体培养基复筛

4．3 优势活性菌株发酵粗提物各组分抗耻垢分枝杆菌测定及活性追踪

4．4 优势活性菌株发酵粗提物各组分的抗肿瘤测定

4．5 一株阳性菌株Actinomadura sp.LZ95的初步研究

5 展望

参考文献

致谢

附录