利用抑制性差减杂交研究镍胁迫下安氏伪镖水蚤响应的分子机理

摘要

近年来，随着城市化进程和工业化发展，环境污染问题日益凸显。其中，重金属污染具有隐蔽性、不可逆性、生物不可降解性、稳定性等特点，因而重金属被看成是危害最大的污染物之一。镍是一种广泛存在的重金属，在痕量时为很多动物生长和繁殖所必需，但高浓度的镍对生物体是有毒的，可以引起皮肤过敏、免疫毒性和肾脏毒性等，镍及其化合物被划分为人类的致癌物。但是关于镍对水生生物的毒性作用及机理的研究相对较少，而安氏伪镖水蚤（Pseudodiaptomusannandalei）具有成为环境指示生物的潜能。本研究以安氏伪镖水蚤为研究对象，构建镍胁迫下安氏伪镖水蚤差异表达基因文库，对文库中筛选到的基因进行全长扩增和深入分析，并对镍胁迫下基因的表达模式进行研究，以期为重金属镍胁迫下水生动物的分子响应机理提供理论依据。
　　 本文的主要研究结果如下:
　　 1.构建镍胁迫下安氏伪镖水蚤SSHcDNA文库以8.86mg/L镍胁迫下的安氏伪镖水蚤为实验组，以未处理的安氏伪镖水蚤为对照组，利用SSH技术构建镍胁迫下安氏伪镖水蚤差异cDNA文库，文库包含重组质粒容量为1.12×106cfu，重组质粒中插入片段大小分布500bp以下约占28.3％，500-1000bp约占63.0％，1000bp以上约占8.7％。
　　 2.克隆获得了安氏伪镖水蚤129个相关表达基因随机测序674个阳性克隆子，经过分析和拼接，共获得129个安氏伪镖水蚤基因。经基因本体释义工具分析，有119个基因分别参与了不同的生物学过程。其中，34个(26.4％)参与了细胞新陈代谢过程，24个(18.6％)与转录和翻译进程有关，20个(15.5％)参与抗氧化防御和应激响应，11个(8.5％)参与细胞转运和细胞内稳态维持，10个(7.8％)与细胞骨架的组装相关，9个(7.0％)参与生物学调节过程，9个(7.0％)参与细胞信号传导过程。另有10个基因的功能未知，将之划分为未知功能群。
　　 3.SMARTRACEPCR获得了18个包含完整开放阅读框的cDNA序列利用SMART技术批量扩增克隆了18个包含完整开放阅读框的安氏伪镖水蚤表达基因cDNA序列，其中精氨酸激酶、细胞色素c氧化酶Ⅱ、细胞色素c氧化酶Ⅲ、组织蛋白酶D、铁蛋白、热休克蛋白70、热休克蛋白90、热休克蛋白β1、肌球蛋白调节轻链、肌球蛋白碱性轻链1、神经钙离子感应蛋白2、抑制蛋白、核糖体蛋白L10a、核糖体蛋白L3、翻译控制肿瘤蛋白、卵黄蛋白原2等16个为全长序列。深入分析了这些序列的特征，预测其编码蛋白质的性质、结构及功能。
　　 4.分析了6个基因在镍胁迫下的差异表达特性利用荧光定量PCR方法分析了MnSOD、HSP70、HSP90、HSPB1、CTSD和AK等6个基因的差异表达特性，初步揭示了这些基因在不同镍浓度胁迫下的差异表达的模式。

目录

声明

摘要

缩略词中英文对照表

第一章 绪论

1 镍的研究进展

2 重金属胁迫响应基因在甲壳动物中的研究进展

3．安氏伪镖水蚤

4．抑制性差减杂交技术(Suppression subtractive hybridization，SSH)

5 本研究的目的意义及技术路线

第二章 镍胁迫下安氏伪镖水蚤SSH cDNA文库的构建

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 实验方法

2 结果

2．1 总RNA的提取

2．2 SMART PCR cDNA的合成

2．3 镰胁迫下安氏伪镖水蚤SSH cDNA文库构建

2．4 SSH cDNA文库质量的初步分析

3 讨论

4．小结

第三章 EST分析、功能注释及SSH文库的验证

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 实验方法

2 结果

2．1 SSH文库的分析

2．2 SSH中部分基因表达差异验证

3 讨论

4 小结

第四章 安氏伪镖水蚤全长cDNA的获得

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 实验方法

2 结果与讨论

2．1 PCR产物的获得

2．2 基因全长cDNA序列的获得

2．3 序列分析与讨论

3 小结

第五章 镍胁迫下安氏伪镖水蚤响应基因的表达特性

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 实验方法

2 结果

2．1 各处理组总RNA提取

2．2 实时荧光定量PCR体幕的建立

2．3 不同镰胁迫组各目的基因的表达特性

3 讨论

4 小结

结论、创新点与展望

一、论文的主要成果

二、创新点

三、展望

参考文献

在学期间参加的科研活动及成果

致谢