糖尿病对卵母细胞发育的影响及胰岛移植治疗方法的研究

摘要

目的:Ⅰ型糖尿病孕妇在怀孕期间面临严重的生殖问题，如不育、流产、胎儿先天发育异常等等。越来越多证据表明糖尿病对胚胎的这种影响可能是由于母体的高糖环境影响到卵母细胞成熟造成的。胰岛移植是否可以逆转糖尿病对胚胎和卵母细胞成熟造成的影响、能否通过辅助干细胞治疗的方法降低胰岛移植中使用的免疫抑制剂对胚胎和卵母细胞成熟造成的影响等一系列问题需要进行系统的研究。为了解决这些问题，本文首先系统研究糖尿病对胚胎和卵母细胞成熟造成的影响;其次创新性的对比研究了胰岛素注射和胰岛移植逆转糖尿病对胚胎和卵母细胞成熟造成的影响的作用;最后，针对胰岛移植中免疫抑制剂对卵母细胞和胚胎的副作用，研究iPS诱导的MSCs(induced pluripotentstem cell-derived mesenchymal stem cells，iPSC-MSCs)辅助胰岛移植是否可以彻底逆转糖尿病，保护卵母细胞免受高血糖和免疫抑制剂的危害。
　　 方法:(1)我们分别从小鼠卵母细胞核成熟、胞质成熟、孤雌胚胎发育等方面来探究糖尿病对卵母细胞造成影响。(2)为了探究胰岛移植能否逆转糖尿病对卵母细胞造成的损伤，我们采用了同种同基因胰岛移植，从小鼠卵母细胞成熟相关的多项指标进行探究，并与胰岛素注射组进了比较。(3)为了验证iPSC-MSCs，我们采用流式细胞术检测iPSC-MSCs表型，并诱导iPSC-MSCs向成骨细胞、脂肪细胞及内皮细胞分化。(4)为了研究iPSC-MSCs辅助胰岛移植是否可以彻底逆转糖尿病，我们采用同种异体胰岛移植排斥模型，再联合临床一线药物Rapa给药治疗，观察移植物生存期的改变，并探讨其可能的作用机制。
　　 结果:(1)跟对照组相比，糖尿病小鼠卵母细胞排卵量减半、纺锤体异常和染色体异常比例增加、非整倍体率增加、Mad2和Bub1 mRNA相对表达显著增加、孤雌激活囊胚率明显增加。(2)胰岛移植使卵母细胞各项成熟指标均恢复正常，但胰岛素注射不能。(3) iPSC-MSCs形态呈成纤维细胞样、并高表达CD73、CD90、CD105，不表达CD45、CD34、CD14。P18 iPSC-MSCs仍具有多项分化功能，可以向成骨细胞、脂肪细胞、内皮细胞分化。(4)生存期数据表明单独使用iPSC-MSCs不能明显延长胰岛生存期，但联合低剂量Rapa可诱导移植物耐受，彻底逆转了糖尿病。联合组T细胞受到最明显的抑制作用。我们分别从蛋白水平和分子水平对血清及移植物中各类细胞因子进行检测，结果发现Th1、Th17类细胞因子受到抑制，Th2、Treg类细胞因子高表达，这说明iPSC-MSCs与Rapa联合用药的作用机制是调节Th1/Th2、Treg/Th17平衡。
　　 结论:糖尿病影响小鼠卵母细胞核成熟、胞质成熟以及孤雌胚胎发育能力，其可能机制是通过影响纺锤体检测点Mad2和Bub1 mRNA的表达;并首次证实胰岛移植可以彻底逆转糖尿病对卵母细胞造成的损伤，并且治疗效果优于胰岛素注射。我们研究发现iPSC-MSCs与Rapa通过调节Th1/Th2、Treg/Th17平衡来诱导胰岛移植物耐受，并且降低了Rapa的使用剂量。总之，使用细胞免疫耐受策略的胰岛移植是避免Ⅰ型糖尿病引起女性生殖问题的有效途径。

目录

声明

摘要

第一章 前言

1．1．糖尿病并发症及其对生殖系统的影响

1．1．1．糖尿病并发症

1．1．2．糖尿病对生殖系统的影响

1．2．糖尿病治疗

1．2．1．胰岛素注射

1．2．2．胰腺移植

1．2．3．胰岛移植

1．3．胰岛移植面临的问题

1．3．1．胰岛的来源

1．3．2．胰岛移植的免疫排斥反应

1．4．间充质干细胞

1．4．1．MSCs的免疫原性

1．4．2．MSCs免疫调节作用

1．4．3．MSCs发挥免疫调节作用的机制

1．5．间充质干细胞在器官移植中的应用

1．5．1．MSCs在实验动物器官移植模型中的应用

1．5．2．MSCs在临床移植中的应用

1．5．3．iPSC-MSCs

1．6．本文研究的目的、意义及内容

第二章 材料与方法

2．1．实验材料

2．1．1．实验动物

2．1．2．主要试剂

2．1．3．主要仪器

2．2．研究方法

2．2．1．小鼠胰岛移植模型

2．2．2．各用药方案

2．2．3．卵母细胞相关实验方法

2．2．4．间充质干细胞培养、表型及功能鉴定

2．2．5．细胞免疫学研究方法

2．2．6．分子生物学研究方法

2．2．7．统计学分析

第三章 结果与讨论

3．1．糖尿病对卵母细胞损伤

3．1．1．糖尿病对小鼠卵母细胞排卵量的影响

3．1．2．糖尿病对小鼠MⅡ期卵母细胞纺锤体排列及染色体分布的影响

3．1．3．糖尿病对小鼠MⅡ期卵母细胞非整倍体的影响

3．1．4．糖尿病对小鼠MⅡ期纺锤体检测点蛋白Mad2和Bub1 mRNA表达的影响

3．1．5．糖尿病对小鼠卵母细胞孤雌激活能力的影响

3．1．6．小结

3．2．胰岛移植逆转糖尿病对卵母细胞的损伤

3．2．1．胰岛移植对糖尿病小鼠体重和血糖的影响

3．2．2．胰岛移植对糖尿病小鼠卵母细胞排卵量的影响

3．2．3．胰岛移植对糖尿病小鼠MⅡ期卵母细胞纺锤体排列及染色体分布的影响

3．2．4．胰岛移植对糖尿病小鼠MⅡ期卵母细胞非整倍体的影响

3．2．5．胰岛移植对糖尿病小鼠MⅡ期纺锤体检测点蛋白Mad2和Bub1 mRNA表达的影响

3．2．6．胰岛移植对糖尿病小鼠卵母细胞孤雌激活能力的影响

3．2．7．小结

3．3．iPSC-MSCs培养及鉴定

3．3．1．iPSC-MSCs培养形态学观察

3．3．2．iPSC-MSCs免疫表型检测

3．3．3．iPSC-MSCs向成骨细胞诱导分化

3．3．4．iPSC-MSCs向脂肪细胞诱导分化

3．3．5．iPSC-MSCs向内皮细胞诱导分化

3．3．6．小结

3．4．iPSC-MSCs联合低剂量Rapa诱导胰岛移植物耐受

3．4．1．iPSC-MSCs联合低剂量Rapa诱导同种异体胰岛免疫耐受

3．4．2．iPSC-MSCs抑制T细胞增殖

3．4．3．iPSC-MSCs对脾脏中T细胞亚群的比例变化的影响

3．4．4．iPSC-MSCs联合低剂量Rapa诱导调节性T细胞产生

3．4．5．iPSC-MSCs对血清中细胞因子的影响

3．4．6．iPSC-MSCs对移植部位细胞因子mRNA相对表达量的影响

3．4．7．iPSC-MSCs保护同种异体胰岛移植物并减少炎细胞浸润

3．4．8．小结

第四章 结论与展望

4．1．结论

4．1．1．胰岛移植逆转糖尿病对小鼠卵母细胞造成的损伤

4．1．2．iPS-MSC诱导联合低剂量Rapa同种异体胰岛移植物耐受

4．2．展望

参考文献

附录

附录一：图表索引

附录二：缩略语及中英文对照

附录三：攻读博士期间发表的学术论文

致谢