东方肉座菌EU7-22纤维素降解酶系及其基因表达的研究

摘要

随着石油资源的日渐枯竭以及人类对能源需求的增长，寻求廉价的、清洁的可再生能源已成为世界各国共同目标。纤维素生物质是地球上最重要的可再生资源，全球每年通过植物光合作用合成的生物质高达2000亿吨以上。纤维素酶和半纤维素酶是一种生物催化剂，它能有效地将纤维素生物质水解成糖类物质，通过进一步转化加工成人类所必需的生物基燃料、生物基化学品和生物基材料。纤维素生物质的利用与转化对于解决环境污染以及能源危机等问题具有十分重要的意义。纤维素酶与半纤维素酶主要由微生物生物合成，如何提高微生物分泌表达酶蛋白的能力，已成为科学界重要的研究热点问题。
　　 东方肉座菌EU7-22是本实验室对东方肉座菌XC-9进行复合诱变而获得的突变株，该菌株不但能够分泌外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶及β-葡萄糖苷酶，也可以分泌表达大量的半纤维素酶，这对降解纤维素生物质非常利。但该菌株EU7-22产纤维素酶水平仍不能达到工业化生产要求。因此，本研究对该菌株纤维素降解酶系进行了系统分析，并从分了水平上对该菌株进行改造，实现大幅提高纤维素酶活力的目标。本论文的主要结果如下:
　　 （一）本文从东方肉座菌EU7-22中首次克隆得到了纤维素酶基因（cbhⅠ、cbhⅡ、egⅠ、egⅡ、egⅢ、egⅣ、β-bgl1），半纤维素酶基因(xynⅠ、xynⅡ、β-bxl1)及其转录调控因子基因（cre1、ace1、xyr1、hap2、hap3、hap5）。这些基因及编码蛋白质的氨基酸序列与木霉属其它菌株如里氏木霉，绿色木霉和康宁木霉相应基因及编码蛋白质具有较高同源性，最高可达到99％。
　　 （二）利用SDS-PAGE分析了菌株EU7-22在以预处理芒草为诱导物和3％的葡萄糖为阻遏物条件下的分泌表达蛋白。结果表明有5个特异蛋白条带(bandⅠ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ)不受葡萄糖阻遏抑制。经MALDI-TOF/TOF鉴定bandⅠ属于天冬氨酸蛋白水解酶，这也是五种蛋白质中表达量最强的蛋白质;bandⅢ和Ⅳ属于一种预测蛋白;bandⅤ属于木葡聚糖酶或β-木糖苷酶。PCR扩增得到菌株EU7-22蛋白条带Ⅰ基因序列全长1280bp，与里氏木霉的proA基因同源性最高达100％。该基因含有1个内含子，编码天冬氨酸蛋白水解酶，包含407个氨基酸，预测的相对分子量为42.6kDa。采用GenomeWalking技术克隆得到1200bp的proA上游区域序列，该序列含有典型的启动子特有元件，包括1个TATA盒及3个CAAT盒。
　　 （三）借助中间质粒载体pUC19和pcDNA3.1(-)，构建了以推定的proA启动子、构巢曲霉的色氨酸合成酶C基因的转录终止子TtrpC为基本元件，表达EGFP和东方肉座菌EU7-22bgl1基因的双元表达载体pUR5750-EGFP和pUR5750-Bgl1。以潮霉素抗性基因为筛选标记。pUR5750-EGFP通过根癌农杆菌EHA105成功转化东方肉座菌EU7-22中，获得6株转化子。分子检测表明此6株转化子中均含有EGFP基因;以蓝光为激发光在荧光显微镜下观察6个转化子的菌丝，均能够发绿色荧光，表明推定的proA启动子能够驱动EGFP基因表达。pUR5750-Bgl1通过根癌农杆菌AGL1成功转化东方肉座菌EU7-22中，获得4株转化子（东方肉座菌Bgl-1、Bgl-2、Bgl-3、Bgl-4）。但分子检测表明只有转化子Bgl-2和Bgl-3中成功转化了基因表达盒PproA-Bgl1-TtrpC。转化子Bgl-2产纤维素酶能力有所提高，但是Bgl-3产酶能力下降。在预处理芒草为诱导物条件下，转化子Bgl-2相比受体菌株EU7-22，FPA和BG酶活分别提高了10.6％和19.1％;菌株Bgl-2的bgl1基因表达量是菌株EU7-22的5.3倍。在以葡萄糖为阻遏物条件下，转化子Bgl-2相比受体菌株EU7-22，FPA和BG酶活分别提高了22.2％和700％;菌株Bgl-2的bgl1基因表达量是菌株EU7-22的9.4倍。表明proA启动子具有较强抗葡萄糖阻遏能力。
　　 （四）将pUC19载体上限制性内切核酸酶SacⅠ替换成SpeⅠ与BssHⅡ，得到改造载体pUC19G。将pUR5750上潮霉素抗性标记盒片段PgpdA-hph-TtrpC连接到pUC19G载体上，构建中间敲除载体pUC19G-PHT。根据里氏木霉基因组中公布的碳代谢阻遏蛋白cre1基因上游区域序列，设计引物，PCR扩增得到东方肉座菌EU7-22cre1基因上游区域1955bp核酸序列。根据菌株EU7-22cre1基因序列，设计引物，采用GenomeWalking技术，PCR扩增得到cre1基因下游区域2025bp核酸序列。借助载体pUC19G-PHT，构建了携带cre1基因上下游区域序列的两个同源臂片段(1950bp/1450bp)的基因敲除载体pUR5750/cre1∷hph。采用根癌农杆菌EHA105介导转化，将⊿cre1∷hph敲除盒定点的插入到东方肉座菌EU7-22cre1基因中，获得基因敲除突变株，东方肉座菌CF1D（HypocreaorientalisCF1D）和东方肉座菌CF1-2(HypocreaorientalisCF1-2)。在微晶纤维素诱导下，相比受体菌株EU7-22，突变株CF1D与CF1-2分泌表达的FPA酶活分别提高了45.00％和41.25％;CMC酶活分别提高了14.79％和13.00％;CBH酶活分别提高了71.11％和64.44％;BG酶活分别提高了151.92％和140.38％;木聚糖酶活分别提高了172.12％和211.47％;蛋白表达量分别提高了92.45％和83.02％。在3％的葡萄糖为阻遏物条件下，相比受体菌株EU7-22，突变株CF1D与CF1-2分泌表达的FPA酶活分别提高了572.73％和454.55％;CMC酶活分别提高了650.25％和543.78％;CBH酶活分别提高了928.57％和742.86％;BG酶活分别提高了1070.00％和1130.00％;木聚糖酶活分别提高了823.66％和689.78％;蛋白表达量分别提高了2700.00％和2400.00％。
　　 （五）东方肉座菌EU7-22不但能够分泌表达纤维素酶，并且同时能够生物合成半纤维素酶。采用Plackett-Burman实验设计，最陡爬坡实验，响应面优化了最佳产酶条件。实验所得最高木聚糖酶活为269±5.8IU/mL，相比优化之前木聚糖酶酶活为107.6IU/mL，酶活力提高了150％。借助载体pUC19G-PHT，构建了携带β-木糖苷酶基因(β-bxl1)序列的两个同源臂片段(946bp/925bp)的基因敲除载体pUR5750/bxl∷hph，采用根癌农杆菌AGL1介导转化，将⊿xyl∷hph敲除盒定点的插入到东方肉座菌EU7-22β-bxl1中，获得基因敲除突变株东方肉座菌Bxyl-1(HypocreaorientalisBxyl-1)。突变株Bxyl-1所产β-木糖苷酶酶活仅为0.06IU/mL，相比受体菌株EU7-22酶活为0.74IU/mL，降低了91.89％;突变株Bxyl-1所产木聚糖酶酶活提高了7.2％;所产纤维素酶酶活基本没有变化。添加相等酶活的木聚糖酶(200IU)，菌株EU7-22分泌的酶液酶解山毛榉材木聚糖，所得木糖产量随着酶解时间延长不断增加，并且产量明显高于菌株Bxyl-1;菌株Bxyl-1分泌酶液酶解底物所得木二糖产量，随着酶解时间延长不断增加，并且产量明显高于菌株EU7-22。两株菌发酵酶液酶解得到的木三糖，木四糖，木五糖，木六糖的产量没有太大的差异。
　　 （六）根据里氏木霉、绿色木霉Gv29-8、哈茨木霉IMI206040基因组中公布的DNA解旋酶，ATP依赖性KU70蛋白亚基ku70基因序列，设计引物，PCR扩增得到东方肉座菌EU7-22ku70基因上游区域1736bp，ku70基因下游区域1875bp的核酸序列。ku70基因序列全长2071bp，含有2个内含子，编码蛋白质KU70，包含645个氨基酸;NCBIBlast比对结果显示与里氏木霉QM6a、绿色木霉Gv29-8、哈茨木霉IMI206040KU70蛋白氨基酸序列同源性分别为96％、86％、84％。借助载体pUC19G-PHT，构建了携带ku70基因上下游区域序列的两个同源臂片段(1680bp/2100bp)的基因敲除载体pUC19G/ku70∷hph，采用原生质体/PEG介导转化，将⊿ku70∷hph敲除盒定点的插入到东方肉座菌EU7-22ku70基因中，获得基因敲除突变株东方肉座菌S-UJ2(HypocreaorientalisS-UJ2)。突变株S-UJ2在含100～200μg/mL的潮霉素抗性平板上能够生长，但是在300μg/mL及更高浓度的潮霉素抗性平板上不能生长。突变株S-UJ2与受体菌株EU7-22，在以预处理芒草纤维素为诱导物条件下，分泌表达的纤维素酶酶活性基本没有改变。
　　 综上所述，本论文分析了菌株EU7-22分泌表达纤维素酶与半纤维素酶，克隆了纤维素酶系及调控因子基因，研究了酶基因的表达及调控，构建了高效基因分析的受体菌株，为更好地深入研究纤维素酶系基因功能奠定基础。

目录

声明

摘要

缩略语中英文对照

第一章 前言

1．1 纤维素生物质

1．1．1 纤维素

1．1．2 半纤维素

1．1．3 木质素

1．1．4 纤维素生物质预处理

1．2 纤维素酶

1．2．1 纤维素酶组成

1．2．2 纤维素酶分子结构

1．3 半纤维素酶

1．4 丝状真菌纤维素酶系基因表达调控研究

1．4．1 纤维素酶系转录调控因子

1．4．2 高效表达纤维素酶系基因启动子选择

1．4．3 纤维素酶系基因表达遗传转化

1．5 本论文研究目的及研究内容

第二章 东方肉座菌EU7-22纤维素酶与半纤维素酶及其主要调控因子基因的克隆

2．1 材料与方法

2．1．1 菌株和质粒

2．1．2 主要试剂

2．1．3 培养基及溶液配制

2．1．4 主要实验仪器

2．1．5 菌株总DNA提取

2．1．6 引物设计

2．1．7 纤维素酶与半纤维素酶及其调控因子基因PCR扩增条件

2．1．8 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备及转化

2．1．9 阳性克隆子筛选

2．1．10 纤维素酶与半纤维素酶及其调控因子基因的生物信息学分析

2．2 结果与分析

2．2．1 PCR扩增纤维素酶与半纤维素酶基因片段

2．2．2 纤维素酶与半纤维素酶基因克隆子筛选

2．2．3 纤维素酶与半纤维素酶基因序列分析

2．2．4 纤维素酶与半纤维素酶ProtParam分析

2．2．5 纤维素酶与半纤维素酶SignalP分析

2．2．6 纤维素酶与半纤维素酶NetNGlyc分析

2．2．7 纤维素酶与半纤维素酶功能性模体的搜索及三级结构模拟

2．2．8 调控因子基因克隆及序列分析

2．3 讨论与结论

2．3．1 讨论

2．3．2 结论

第三章 东方肉座菌EU7-22抗葡萄糖阻遏蛋白分析及其启动子克隆

3．1 材料与方法

3．1．1 菌株与质粒

3．1．2 主要试剂及材料

3．1．3 主要实验仪器

3．1．4 培养基及溶液配制

3．1．5 芒草预处理

3．1．6 东方肉座菌EU7-22培养

3．1．7 葡萄糖标准曲线绘制

3．1．8 对硝基酚标准曲线的绘制

3．1．9 Bradford法测定蛋白浓度

3．1．10 诱导条件下产纤维素酶分析

3．1．11 阻遏条件下产纤维素酶分析

3．1．12 粗酶液制备

3．1．13 纤维素酶活测定

3．1．14 SDS-PAGE电泳分析发酵酶液

3．1．15 蛋白质质谱分析

3．1．16 蛋白质的编码基因克隆

3．1．17 启动子proA克隆

3．2 结果与分析

3．2．1 标准曲线绘制

3．2．2 不同纤维素诱导物对菌株EU7-22产纤维素酶影响

3．2．3 纤维二糖对菌株EU7-22产纤维素酶影响

3．2．4 葡萄糖对菌株EU7-22产纤维素酶影响

3．2．5 在葡萄糖阻遏条件下表达蛋白质谱分析

3．2．6 抗葡萄糖阻遏蛋白基因克隆及序列分析

3．2．7 proA基因上游区域核酸序列克隆及分析

3．3 讨论与结论

3．3．1 讨论

3．3．2 结论

第四章 东方肉座菌EU7-22抗葡萄糖阻遏启动子(proA)内源高表达β-葡萄糖苷酶基因

4．1 材料与方法

4．1．1 菌株与质粒

4．1．2 主要试剂及材料

4．1．3 主要实验仪器

4．1．4 培养基及溶液配制

4．1．5 东方肉座菌EU7-22对抗生素抗性分析

4．1．6 表达载体pUR5750-EGFP构建

4．1．7 表达载体pUR5750-Bgl1构建

4．1．8 根癌农杆菌介导转化东方肉座菌EU7-22

4．1．9 增强型绿色荧光蛋白基因表达分析

4．1．10 β-葡萄糖苷酶Ⅰ基因表达分析

4．1．11 β-葡萄糖苷酶Ⅰ基因表达转化子产纤维素酶分析

4．2 结果与分析

4．2．1 东方肉座菌EU7-22对抗生素敏感性分析

4．2．2 双元表达载体pUR5750-EGFP构建

4．2．3 双元表选载体pUR5750-Bgl1构建

4．2．4 根癌农杆菌介导双元表达载体转化体系的建立

4．2．5 绿色荧光蛋白基因表达转化子分析

4．2．6 β-葡萄糖苷酶Ⅰ基因表达转化子分析

4．2．7 β-葡萄糖苷酶Ⅰ基因表达转化子产酶分析

4．3 讨论与结论

4．3．1 讨论

4．3．2 结论

第五章 东方肉座菌EU7-22碳代谢阻遏蛋白编码基因Cre1敲除研究

5．1 材料与方法

5．1．1 菌株与质粒

5．1．2 主要试剂及材料

5．1．3 主要实验仪器

5．1．4 培养基及溶液配制

5．1．5 质粒载体pUC19改造

5．1．6 基因敲除中间载体pUC19G-PHT构建

5．1．7 Cre1基因上下游序列克隆

5．1．8 Cre1基因敲除载体pUR5750／Cre1∷hph构建

5．1．9 根癌农杆菌EHA105介导双元载体pUR5750／Cre1∷hph转化

5．1．10 △Cre1转化子分子分析

5．1．11 △Cre1转化子产纤维素酶与木聚糖酶分析

5．2 结果与分析

5．2．1 pUC19载体改造

5．2．2 pUC19-PHT载体构建

5．2．3 基因克隆cre1上下游区域序列

5．2．4 pUR5750／Cre1∷hph基因敲除载体构建

5．2．5 根癌农杆菌介导转化基因敲除藏体pUR5750／Cre1∷hph转化

5．2．6 △Cre1转化子分子检测

5．2．7 △Cre1基因敲除转化子产酶分析

5．3 讨论与结论

5．3．1 讨论

5．3．2 结论

第六章 东方肉座菌EU7-22分泌表达半纤维素酶研究

6．1 材料与方法

6．1．1 菌株与质粒

6．1．2 主要试剂与材料

6．1．3 主要实验仪器

6．1．4 培养基及溶液配制

6．1．5 标准曲线绘制

6．1．6 木糖及木寡糖HPLC标准曲线绘制

6．1．7 酶活测定

6．1．8 菌株EU7-22产木聚糖南条件优化

6．1．9 不同诱导底物对菌株EU7-22产木聚糖酶影响

6．1．10 bxl1基因敲除载体pUR5750／bxl∷hph构建

6．1．11 根癌农杆菌AGL1介导载体pUR5750／bxl∷hph转化

6．1．12 △bxl转化子分子分析

6．1．13 △bxl转化子产半纤维素酶与纤维素酶分析

6．1．14 山毛榉材木聚糖酶解分析

6．2 结果与分析

6．2．1 木糖标准曲线

6．2．2 最佳产木聚糖酶条件优化

6．2．3 诱导底物对菌株EU7-22产木聚糖酶影响

6．2．4 pUR5750／bxl∷hph基因敲除载体构建

6．2．5 根癌农杆菌介导基因敲除载体pUR5750／bxl∷hph转化

6．2．6 △bxl转化子分子检测

6．2．7 △bxl转化子产酶分析

6．2．8 木糖与木寡糖HPLC标准曲线绘制

6．2．9 酶解山毛榉材木聚糖分析

6．3 讨论与结论

6．3．1 讨论

6．3．2 结论

第七章 东方肉座菌EU7-22纤维素酶系基因分析高效受体系统构建

7．1 材料与方法

7．1．1 菌株与质粒

7．1．2 主要试剂及材料

7．1．3 主要实验仪器

7．1．4 培养基及溶液配制

7．1．5 东方肉座菌EU7-22ku70基因克隆

7．1．6 ku70基因敲除载体pUC19G／ku70∷hph构建

7．1．7 △ku 70∷hph敲除盒

7．1．8 东方肉座菌EU7-22原生质体制备及转化

7．1．9 △ku70转化子分子分析

7．1．10 △ku70转化子对潮霉素敏感性分析

7．1．11 △ku70转化子产纤维素酶分析

7．2 结果与分析

7．2．1 东方肉座菌EU7-22ku70基因克隆

7．2．2 pUC19G ／ku70∷hph基因敲豫载体构建

7．2．3 △ku70∷hph敲除盒获取

7．2．4 △ku70转化子分子检测

7．2．5 △ku70转化子对潮霉素抗性分析

7．2．6 △ku70转化子产酶分析

7．3 讨论与结论

7．3．1 讨论

7．3．2 结论

全文总结与展望

附录Ⅰ 主要实验仪器设备

附录Ⅱ 蛋白质鉴定肽指纹图谱

附录Ⅲ Cre1和ku70基因上下游区域核酸序列

参考文献

科研项目和论文与学术交流及获得奖励

致谢