两株DENV-2E蛋白N端158氨基酸基序与DC相互作用的研究

摘要

目的:
　　通过构建2型登革病毒临床分离株（DENV-2 B株）和国际参考株（DENV-2 NGC株）E基因区部分序列的原核表达载体，进行蛋白表达、复性和纯化，制备特异性多克隆抗体，并研究表达蛋白与DC的相互作用。
　　方法:
　　分别将B株和NGC株E基因1-476bp序列克隆入原核表达载体pET28a(+)载体，分别命名为pET28a(+)/B-E，pET28a(+)/NGC-E。酶切、测序鉴定正确后转化表达菌Rosetta，IPTG诱导后将包涵体变性，复性，纯化;用纯化蛋白免疫C57BL/6和BALB/c小鼠制备多克隆抗体，并通过western blot和间接ELISA法鉴定抗体。对经蛋白免疫3周后的C57BL/6小鼠注射病毒，检测小鼠血清抗巨蛋白特异性IgG类抗体滴度。将两种蛋白分别与人外周血新鲜分离诱导的DC共孵育48小时，比较两种蛋白与DC的结合情况、DC表型的变化和IL-12的分泌。
　　结果:
　　1、构建pET28a(+)-B-E/pET28a(+)-NGC-E原核表达重组质粒，经酶切，PCR，测序鉴定，挑选含有正确序列的重组质粒。
　　2、将pET28a(+)-B-E/pET28a(+)-NGC-E转入Rosetta菌表达E蛋白，E基因区DomainⅠ序列获得高效表达，相对分子量约20kDa;Western-blot结果表明目的蛋白的His标签可与抗His标签的单克隆抗体结合，进一步验证目的蛋白为外源表达的E蛋白。对蛋白进行变性、复性，用Ni柱亲和层析法纯化蛋白，得到的E蛋白纯度高于90％。
　　3、将纯化后的E蛋白免疫BALB/c和C57BL/6小鼠分别获得特异性多克隆抗体，间接ELISA法检测C57BL/6小鼠抗E蛋白特异性IgG类抗体滴度为1∶12800，Western-blot检测BALB/c小鼠特异性IgG类抗体滴度大于1∶500，并可用于FACS检测。
　　4、用两种蛋白免疫C57BL/6小鼠3周后腹腔注射DENV-2 NGC株病毒，发现注射病毒后0-72小时NGC-E蛋白免疫的小鼠产生的抗E蛋白特异性IgG类抗体水平较高，但第6天时B-E蛋白免疫小鼠产生特异性IgG类抗体水平高于NGC-E蛋白免疫小鼠。
　　5、用IL-4和GM-CSF诱导人外周血PBMC，7天后得到纯度高于90％的未成熟DC。
　　6、通过流式细胞法，激光共聚焦显微镜观察到PBMC来源的DC可以有效的与两种E蛋白结合，NGC-E与DC的结合率较高;并观察到，作用48小时NGC-E可使DC表面CD80，CD83，CD86，HLA-DR，CD11c表达增加;双抗体夹心ELISA法检测表明，NGC-E可以使DC分泌大量IL-12;相同时间内B-E不能诱导DC成熟。
　　结论:
　　1.pET28a(+)-B-E/pET28a(+)-NGC-E转入Rosetta菌表达E蛋白，得到复性蛋白纯度高于90％，相对分子量约20kDa;
　　2.B-E对BALB/c和C57BL/6小鼠均具有免疫原性。可刺激小鼠产生特异性抗体;并可用于ELISA、Western-blot和FACS检测。
　　3.用两种蛋白免疫C57BL/6小鼠3周后腹腔注射DENV-2 NGC株病毒，发现两组小鼠产生抗E蛋白特异性IgG类抗体动态水平有差异。
　　4.NGC-E作用PBMC来源的DC48小时可诱导DC成熟，相同时间内B-E不能诱导DC成熟。

目录

摘要

1．前言

2．材料与方法

2．1 材料

2．2 试剂

2．3 主要仪器设备

2．4 方法

3．结果

3．1 重组质粒的鉴定

3．2 蛋白表达及纯化

3．3 B-E蛋白抗血清的制备

3．4 B-E蛋白免疫效果的初步检测

3．5 外周血PBMC诱导DC

3．6 检测E蛋白与DC的结合

3．7 蛋白可以诱导DC成熟而B-E不能诱导DC成熟

3．8 NGC-E可以使DC分泌大量IL-12

4．讨论

参考文献

在读期间已发表文章

致谢

缩略词表

声明

综述