柠檬酸镧诱导宫颈癌SiHa细胞凋亡的比较蛋白质组学研究

摘要

目的:研究稀土配合物柠檬酸镧([LaCit2]3-)对人宫颈癌SiHa细胞生长的影响，并通过蛋白质表达水平的变化探索[LaCit2]3-诱导宫颈癌SiHa细胞凋亡的机制。
　　方法:用RPMI-1640培养基培养宫颈癌SiHa细胞，传代培养至80％融合后分为处理组和对照组，处理组以含有[LaCit2]3-无血清RPMI-1640培养基培养，对照组用无血清RPMI-1640培养基培养。MTT法检测不同浓度[LaCit2]3-对SiHa细胞增殖的影响，Hochest33258染色法观察[LaCit2]3-对细胞形态学的改变，AnnexinⅤ/PI染色法流式细胞仪检测细胞凋亡率，用JC-1荧光探针检测线粒体膜电位(△ψm)变化，用DCFH-DA荧光探针检测细胞内活性氧(ROS)水平，采用比较蛋白质组学分析细胞总蛋白质表达的变化并选取部分蛋白进行蛋白免疫印迹(Western blotting)验证。
　　结果:0.001～1.0mmol/L[LaCit2]3-浓度范围内处理SiHa细胞24h，能抑制细胞生长。后续实验处理组采用0.06mmol/L[LaCit2]3-无血清RPMI-1640培养基培养12h和24h。12h组及24h组细胞呈现典型凋亡形态。对照组、12h组及24h组凋亡率分别为2.83±1.01％，14.00±0.82％和67.43±3.27％,各处理组与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05），表明[LaCit2]3-作用后细胞凋亡率升高。对照组、12h组及24h组线粒体膜电位的绿/红荧光比值分别为0.14±0.01、0.75±0.09和7.04±0.98，各处理组与对照相比差异有统计学意义(P＜0.05），表明[LaCit2]3-作用后线粒体膜电位明显下降。对照组、12h组及24h组胞内DCF荧光强度分别为8.94±1.92，12h组为18.17±0.91，24h组为29.28±2.82，各处理组与对照相比差异有统计学意义(P＜0.05)，表明[LaCit2]3-作用后胞内ROS水平明显增加。[LaCit2]3-处理24h细胞总蛋白双向电泳分离和质谱鉴定，鉴定出10个差异表达蛋白质点，这些蛋白质在细胞中分别参与凋亡、氧化还原、蛋白降解等过程，并选取过氧化物酶1(PRXⅠ)，钙依赖性磷脂结合蛋白(ANAX1)和肿瘤坏死因子受体相关因子5(TRAF5)进行Westernblotting验证与蛋白质组学结果吻合。
　　结论:[LaCit2]3-通过引发线粒体功能障碍及调节胞内氧化应激水平诱导宫颈癌SiHa细胞凋亡。

目录

摘要

1．前言

2．材料与方法

2．1 材料、试剂

2．2 方法

3．实验结果

3．1 MTT检测柠檬酸镧对SiHa细胞增殖的影响

3．2 Hoechst 33258染色法观察柠檬酸镧对SiHa细胞形态学改变的结果

3．3 Annexin V-FITC／PI双染色法检测柠檬酸镧引起SiHa细胞凋亡率变化的流式结果

3．4 JC-1荧光探针检测柠檬酸镧引起SiHa细胞线粒体膜电位改变的流式结果

3．5 DCFH-DA荧光探针检测柠檬酸镧引起SiHa细胞胞内ROS水平变化的流式结果

3．6 蛋白质组学分析柠檬酸镧影响SiHa细胞蛋白质表达水平变化的结果

3．7 Western blotting验证差异表达的蛋白质

4．讨论

结论

创新及展望

参考文献

致谢

研究生期间的学术研究成果

缩略词表

声明

综述 稀土的抗肿瘤研究进展及影响因素