烷基多环芳烃对海水青鳉(Oryzias melastigma)胚胎毒性及代谢转化机制研究

摘要

烷基多环芳烃(Alkyl-PolycyclicAromaticHydrocarbons，Alkyl-PAHs)占石油毒性组分PAHs的80％以上，对鱼类早期发育具有慢性毒性，但该类化合物未受到足够重视，且作用机制尚不明确。而近期研究表明，部分AlkyI-PAHs毒性强于其母体，在石油污染及PAHs混合物毒性中可能扮有重要作用，当前以非烷基PAHs为主的风险评估模型可能低估了其实际风险。因此，针对Alkyl-PAHs具有含量高、部分化合物毒性强于其母体、毒性机制不明等问题，本研究选取典型Alkyl-PAHs-惹烯(7-isopropyl-1-methylphenanthrene，Retene，Ret)和其母体-菲（Phenanthrene，Phen）为关注化合物，以海水青鳉鱼(Marinemedaka，Oryziasmelastigma)作为受试生物，通过AlkyI-PAHs与其母体毒性比较的方式，从形态学（发育畸形）、生理机能（孵化率、死亡率和孵化周期）、生化指标（EROD、GST、LPO和CYP1A蛋白）、代谢产物和差异蛋白质等多个层面探讨Ret对海水青鳉胚胎毒性及代谢转化机制，研究成果不仅可丰富我们对Alkyl-PAHs毒性的认识，还可对PAHs的污染监测、混合物毒性评估和作用机制研究等提供新的启迪或借鉴，具有一定的理论和实际意义。研究取得如下结果:
　　 1)Ret对海水青鳉早期发育致死效应和致畸效应都明显强于其母体菲（25d-LC50分别为221.8μg/L和＞800μg/L，25d-EC50分别为92.1μg/L和174.9μg/L）;Ret和母体Phen都可改变海水青鲻胚胎的正常发育，引起循环降低(CR)、卵黄囊水肿(YE)、围心腔水肿(PE)和心脏拉长(SH)等畸形，二者引起畸形的严重程度上依次为SH＞PE＞YE＞CR和YE＞CR＞PE＞SH，母体Phen引起YE和CR发病时间(7d)要早于PE和SH(8d)，而Ret最早发病的为PE(6d)，其次依次为SH(7d)、YE(7d)和CR(10d)，表明二者在毒性作用方式上存在差异。
　　 2)Ret在诱导EROD、GST、CYP1A蛋白表达和LPO等方面都强于母体Phen，Ret体内残留浓度低于母体Phen，表明Ret比其母体Phen更易被代谢转化;ANF可抑制Ret对CYP1A酶活性诱导，提升母体Ret的体内残留浓度，但毒性有所缓解，表明Ret毒性可能由CYP1A介导的代谢物所引起。
　　 3)采用代谢预测模型(Meteor)和液质(LC-MS)相结合方法对代谢产物进行了分析，发现Ret的代谢途径可能涉及苯环和甲基支链上的单加氧羟基化和双加氧羟基化等氧化过程，部分Ⅰ相代谢物可进一步氧化形成醌类和环氧化物等活性物质，部分Ⅰ相代谢物经GST、谷氨酰转移酶(GT)、肽酶和尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶(UDPGT)催化形成Ⅱ相结合物，该代谢过程复杂于母体Phen，代谢所产生的活性中间产物可能在Ret毒性中扮演重要角色。
　　 4)采用非标记液相色谱质谱串联技术（label-freeLC-MS/MS）方法对Ret和母体Phen胚胎毒性的蛋白质组学研究发现:各样品共获得393个可信蛋白，经筛选Ret和母体Phen中分别有166个和141个蛋白具有显著差异(P＜0.05;与对照组相比差异＞1.5倍)，差异蛋白个数远多于2-DE图像法（39个）;Ret和母体Phen中成功鉴定蛋白的个数分别为39个和30个，它们多数参与生物调控和代谢过程、少数参与细胞转运和应激反应等生物学过程;Ret和母体Phen胚胎毒性可能由氧化应激、细胞骨架破裂和能量代谢紊乱等途径引发，但在信号通路上二者可能存在差异，Ret更倾向于能量合成和代谢途径。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一章 前言

1．1．立项依据

1．2．相关领域国内外研究进展

1．2．1 多环芳烃(Polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs)

1．2．2 烷基多环芳烃(Alkyl-Polycyclic Aromatic Hydrocarbons，Alkyl-PAHs)

1．2．3 PAHs代谢转化及毒性

1．2．4 PAHs对鱼类早期发育毒性及作用机制

1．2．5 蛋白质组学技术在海洋生态毒性学研究中的应用

1．2．6 海水青鳉(Marine medaka，Oryzias melastigma)

1．3．研究目标和内容

1．4．技术路线

第二章 惹烯对海水青鳉(Oryzias melastigma)早期生活阶段的毒性研究

2．1 研究目的

2．2 材料与方法

2．2．1 试剂

2．2．2 海水青鳉养殖及鱼卵收集

2．2．3 实验设计

2．2．4 BSD指数(BSD Index)和严重指数(Severity Index，SI)

2．2．5 EROD活性测定

2．2．6 GST和LPO测定

2．2．7 胚胎CYP1A蛋白表达测定(Westernblot方法)

2．2．8 Phen和Ret水体及体内浓度分析

2．2．9 数据处理与统计分析

2．3 结果

2．3．1 暴露水体中Phen和Ret的浓度

2．3．2 死亡率、畸形率和孵化周期

2．3．3 BSD指数和严重指数(Severity index，SI)

2．3．4 EROD

2．3．5 GST

2．3．6 LPO

2．3．5 GST

2．3．6 LPO

2．3．7 CYP1A蛋白

2．3．8 体内Phen和Ret浓度

2．4 讨论

2．4．1 Phen对海水青鳉早期发育毒性

2．4．2 Ret对海水青鳉早期发育毒性

2．5 小结

第三章 CYP1A在惹烯对海水青鳉(Oryzias melastigma)胚胎发育毒性中的作用

3．1 研究目的

3．2 材料与方法

3．2．1 试剂

3．2．2 实验设计

3．2．3 BSD指数

3．2．4 EROD、GST、LPO活性和CYPlA蛋白表达

3．2．5 水体和体内Ret含量分析

3．2．6 数据处理与统计分析

3．3 结果

3．3．1 暴露水体中Ret的浓度变化

3．3．2 ANF对海水青鳉胚胎发育的影响

3．3．3 Ret与ANF联合暴露对海水青鳉胚胎发育的影响

3．4 讨论

3．4．1 ANF对海水青鳉的发育毒性

3．4．2 ANF与Ret联合暴露对海水青鳉的发育毒性

3．5 小结

第四章 惹烯在海水青鳉(Oryzias melastigma)胚胎体内代谢转化的初步研究

4．1 研究目的

4．2 材料与方法

4．2．1 试剂

4．2．2 实验设计

4．2．3 样品处理

4．2．4 代谢产物分析

4．2．5 Phen和Ret代谢产物预测方法

4．3 结果

4．3．1 Phen和Ret代谢产物预测结果

4．3．2 Phen和Ret质谱分析结果

4．3．3 Phen和Ret代谢途径分析

4．4 讨论

4．4．1 Phen在海水青鳉胚胎体内的代谢

4．4．2 Ret在海水青鳉胚胎体内的代谢

4．5 小结

第五章 惹烯对海水青鳉(Oryzias melastigma)胚胎发育的差异蛋白质研究

5．1 研究目的

5．2 材料与方法

5．2．1 实验设计

5．2．2 蛋白样品制备和定量

5．2．3 双向凝聚电泳(2-DE)

5．2．4 2-DE图像扫描与分析

5．2．5 蛋白质酶解

5．2．6 色谱分离和质谱分析

5．2．7 质谱数据分析方法

5．2．8 差异表达蛋白的Gene Ontology(GO)和相互作用分析

5．3 结果

5．3．1 2-DE图像分析

5．3．2 蛋白质组定性定量分析

5．3．3 差异蛋白的功能分类

5．3．4 蛋白相互作用分析

5．4 讨论

5．4．1 Phen对海水青鳉胚胎毒性的差异蛋白质组学

5．4．2 Ret对海水青鳉胚胎毒性的差异蛋白质组学

5．5 小结

第六章 结论与展望

6．1 主要结论

6．1．1 Ret的毒性强于母体Phen，二者作用方式可能不同

6．1．2 代谢产物可能是Ret毒性的主要诱因

6．1．3 Ret的代谢途径不同于母体Phen

6．1．4 Ret发育毒性的信号通路存在差异

6．1．5 CYP1A抑制剂和CYP1A诱导剂混合物毒性的多变性

6．2 创新点

6．3 研究展望

附件1 USEPA 16种优先控制PAHs信息

附件2 海水青鳉鱼各发育阶段特征

附件3 海水青鳉胚胎-卵黄囊仔鱼期BSD赋分方法

附件4 菲和惹烯对海水青鳉胚胎的蛋白鉴定原始数据

参考文献

图表索引

攻读博士期间发表论文及参与课题情况

致谢