家蝇幼虫血淋巴中抗肿瘤蛋白的筛选及对Hep-2细胞作用机制初探

摘要

目的:筛选3日龄家蝇幼虫血淋巴中的具有抗肿瘤作用的蛋白;通过体外实验初步探讨抗肿瘤蛋白对Hep-2细胞系的作用机制。
　　方法:1、家蝇幼虫血淋巴蛋白的制备:采用针刺法提取热诱导后的3龄家蝇幼虫血淋巴，用固相萃取分离法，以乙腈溶液作洗脱剂，分离纯化家蝇幼虫血淋巴中的抗肿瘤蛋白组分。2、抗肿瘤活性检测:应用不同浓度的抗肿瘤蛋白作用于人喉癌Hep-2细胞系不同作用时间后，观察细胞形态的变化，MTT抑制率检测，筛选抗肿瘤蛋白有效的作用时间和作用浓度。3、抗肿瘤蛋白对Hep-2细胞作用机制的初步研究:1）观察肿瘤细胞生长增殖抑制情况:选用MTT法检测，初步分析对Hep-2细胞的抑制效果;2）检测肿瘤细胞凋亡:选用细胞爬片的HE染色法，初步观察有无细胞凋亡;进而提取细胞DNA进行琼脂糖凝胶电泳分析，观察是否出现阶梯状凋亡条带出现，判断对细胞DNA有无损伤作用;检测肿瘤细胞胞膜变化:扫描电镜观察经抗肿瘤蛋白作用后的Hep-2肿瘤细胞，观测细胞膜的改变情况。以上四组实验均设正常细胞对照。
　　结果:1）细胞形态观察结合MTT抑制率检测结果发现，10％-50％萃取组分对Hep-2细胞的生长均有抑制作用，并且蛋白浓度在12.5μ g/ml、作用时间12h的抑制效果较好;同时发现40％和50％萃取组分的蛋白对肿瘤细胞的增值抑制较为明显;2）细胞爬片的HE染色观察发现，经抗肿瘤蛋白作用后，Hep-2细胞中出现细胞核浓缩，核质深染成蓝紫色的凋亡小体;DNA凝胶电泳结果显示，未见DNA损伤后的阶梯状凋亡条带;扫描电镜观察发现，蛋白作用后的Hep-2细胞胞膜有明显改变:细胞表面凹凸不平，有明显的出泡状隆起，微绒毛消失，相较于正常细胞密集的突起。
　　结论:1）证实家蝇幼虫血淋巴中具有抑杀肿瘤细胞作用的蛋白组分，以40％和50％萃取组分对肿瘤细胞的增值抑制较为明显;2）抗肿瘤蛋白作用Hep-2细胞的最有效作用浓度为12.5μg/mL，最有效作用时间为12h;3）家蝇幼虫血淋巴中抗肿瘤蛋白能促进Hep-2肿瘤细胞凋亡，细胞膜形态发生明显改变，而起到抗肿瘤的作用。

目录

摘要

前言

材料与方法

1．材料

2．方法

结果

3．1 固相萃取法初步分离血淋巴

3．2 固相萃取蛋白组分的HPIC分析

3．3 家蝇幼虫血淋巴抗Hep-2细胞萃取蛋白的筛选

讨论

1 昆虫抗菌肽抗肿瘤作用机制的研究进展

2．家蝇幼虫血淋巴中具有抗肿瘤作用蛋白成分的分离、筛选

3．抗肿瘤活性的检测方法和作用机理分析

结论

亟待做的工作

参考文献

致谢

声明

英文缩写词表

综述