人诱导多能干细胞(iPS cells)微流控芯片培养体系的建立

摘要

诱导多能干细胞(Inducedpluripotentstemcells，简称iPScells)是通过将特定的转录因子导入分化的体细胞重编程而成，它的出现是生命科学领域的一次革命。将iPS细胞置于具有微型化、集成化和便携化等优势的微流控芯片上进行研究，将大大加快iPS细胞的研究进程。
　　本研究旨在在微流控芯片中建立稳定的人诱导多能干细胞培养体系，并初步研究了pH对二乙酸荧光素(FDA)进入细胞的影响。
　　本论文主要工作如下:
　　1、分离并培养了小鼠胚胎成纤维细胞，并将传至P3代的小鼠胚胎成纤维细胞用浓度为10μg/mL的丝裂霉素C处理2.5小时，获得了适合人诱导多能干细胞生长的饲养层细胞。
　　2、通过摸索人诱导多能干细胞克隆的特性，在体外建立了稳定的人诱导多能干细胞培养体系，并将其冻存后成功复苏。
　　3、设计并制作了玻璃-玻璃微流控芯片和PDMS-玻璃微流控芯片，并在其上培养了小鼠胚胎成纤维细胞和人诱导多能干细胞，为在芯片上进行进一步的干细胞分化研究提供了基础。
　　4、普通培养皿和微流控芯片中未分化的人诱导多能干细胞碱性磷酸酶(AKP)染色均呈阳性，说明在微流控芯片中能建立稳定的人iPS细胞培养体系。
　　5、通过采用三种不同的pH溶液（pH4、pH5和pH6）及三种处理细胞的时间（10min、20min和30min）来研究pH对二乙酸荧光素(Fluoresceindiacetate，简称FDA)进入细胞的影响，间接表明pH对细胞膜通透性或酯酶活性的影响。

目录

声明

摘要

缩略字表

第一章 引言

1．1 微流控芯片的研究进展

1．1．1 微流控芯片的简介

1．1．2 微流控芯片的特点

1．1．3 微流控芯片在医药研究领域的应用

1．2 干细胞的生物学特性，培养系统及研究进展

1．2．1 干细胞的生物学特性

1．2．2 干细胞的培养系统

1．2．3 干细胞的研究进展

1．3 诱导多能干细胞的生物学特性，分化研究及鉴定

1．3．1 诱导多能干细胞生物学特性及分化研究

1．3．2 诱导多能干细胞的鉴定

1．4 微流控芯片在干细胞研究中的应用

1．5 pH对细胞生命活动影响的简介

1．6 本论文的研究内容和意义

第二章 材料和方法

2．1 实验材料、试剂和仪器

2．1．1 实验材料

2．1．2 实验试剂

2．1．3 实验仪器

2．2 实验方法

2．2．1 小鼠胚胎成纤维细胞的体外分离与原代培养

2．2．2 小鼠胚胎成纤维细胞的传代培养

2．2．3 小鼠胚胎成纤维细胞的冻存与复苏

2．2．4 饲养层细胞的制备

2．2．5 人诱导多能干细胞的传代培养

2．2．6 人诱导多能干细胞的冻存与复苏

2．2．7 人诱导多能干细胞的无饲养层培养

2．2．8 碱性磷酸酶染色鉴定

2．2．9 微流控芯片的设计和制作

2．2．10 微流控芯片中小鼠胚胎成纤维细胞的培养与观察

2．2．11 微流控芯片中人诱导多能干细胞的培养与观察

2．2．12 微流控芯片中pH对FDA进入细胞的影响

第三章 实验结果

3．1 小鼠胚胎成纤维细胞的培养及饲养层细胞的制备

3．1．1 小鼠胚胎成纤维细胞的原代培养和传代培养

3．1．2 饲养层细胞的制备

3．2 人诱导多能干细胞的体外培养与鉴定

3．2．1 人诱导多能干细胞的复苏及传代培养

3．2．2 人诱导多能干细胞的无饲养层培养

3．2．3 碱性磷酸酶染色鉴定

3．3 微流控芯片的设计与制作

3．4 微流控芯片中细胞的培养

3．4．1 PDMS-玻璃微流控芯片中小鼠胚胎成纤维细胞的培养与观察

3．4．2 PDMS-玻璃微流控芯片中人诱导多能干细胞的培养与观察

3．5 微流控芯片中pH对FDA进入细胞的影响

第四章 讨论

4．1 小鼠胚胎成纤维细胞的培养及饲养层细胞的制备

4．1．1 胎龄和酶消化时间对小鼠胚胎成纤维细胞分离培养的影响

4．1．2 细胞代数和丝裂霉素C浓度及处理时间对饲养层细胞质量的影响

4．2 人诱导多能干细胞的体外培养与鉴定

4．2．1 胶原酶、克隆传代大小及细胞密度对人iPS细胞传代的影响

4．2．2 克隆大小和密度对人iPS细胞复苏的影响

4．3 微流控芯片的设计与制作

4．3．1 芯片材料对人iPS细胞在微流控芯片中生长的影响

4．3．2 通道结构对人iPS细胞在微流控芯片中生长的影响

4．3．3 芯片封接方式对人iPS细胞在微流控芯片中生长的影响

4．4 微流控芯片中细胞的培养

4．4．1 PDMS-玻璃微流控芯片中小鼠胚胎成纤维细胞的培养与观察

4．4．2 PDMS-玻璃微流控芯片中人诱导多能干细胞的培养与观察

4．5 微流控芯片中pH对二乙酸荧光素(FDA)进入细胞的影响

第五章 总结与展望

参考文献

致谢