PAHs降解菌—新鞘氨醇杆菌的趋化性研究

摘要

包括多环芳烃(PAHs)在内的持久性有机污染物的微生物降解已成为当今环境科学研究的前沿课题。新鞘氨醇杆菌（Novosphingobium）普遍具有降解芳烃等污染物的特性，是优良的芳烃污染环境修复菌。之前人们对微生物降解芳香族化合物的基因、代谢途径和调控手段等进行了系统地研究。对近年来很热门又很棘手的有机物污染环境治理问题而言，微生物对烃类的摄取机制是重要的课题，揭示微生物捕获PAHs的分子转运机制是实现有机物污染生物修复的重要前提。本论文以新鞘氨醇杆菌为研究对象，以新鞘氨醇杆菌如何捕获疏水性PAHs为突破口，采用基因组学、反转录实时荧光PCR等技术对其趋化性、趋化基因、趋化蛋白表达及其与PAHs降解的关联等方面进行了较为系统地研究，获得的主要结果如下:
　　1.对一株分离自红树林湿地沉积物中PAHs降解菌N.pentaromativoransF2进行了全基因组测序，其基因组精细图构建与生物信息学分析结果显示:F2基因组大小为5.12M，GC含量为63.16％，总共得到33个Scaffold，5，291个基因，占到基因组总长的89.16％;KEGGPATHWAY注释发现有23个基因注释到细菌趋化性通路中，其中5个甲基趋化受体蛋白MCP，1个感受器激酶CheA，1个偶联蛋白CheW，2个反应调节子CheY，2个MCP甲基化酶CheB，2个MCP甲基转移酶CheR，1个融合蛋白cheBR，1个趋化受体谷氨酰胺脱酰胺酶CheD，3个鞭毛马达开关FliG/M/NY，2个鞭毛定子MotA和3个MotB。与其相似性为99.859％的模式菌株N.pentaromativoransUS6-1则有22个基因注释到细菌趋化性通路中，多了CheX但缺少融合蛋白cheBR。
　　2.对已完成全基因组测序的新鞘氨醇杆菌的趋化基因分布进行分析，结果显示它们均至少含一个che簇，能够形成完整的趋化通路，是有实际功能的趋化系统，其中F2、PP1Y和US6-1的che簇中趋化基因排列顺序一致，与亲缘关系稍远的AP12和Rr2-17的趋化基因排列不同，验证了它们之间的亲缘关系，仅Rr2-17有3个趋化基因簇，表明Rr2-17有着较复杂的趋化系统。趋化蛋白组成分析显示新鞘氨醇杆菌均含有MCP、CheW、CheA、CheB、CheR和CheY，组成机制上与Bacillus较相似，与E.coli差别较大。
　　3.用Pfam和MiST数据库将F2和US6-1的趋化蛋白结构域可视化，结果显示它们的趋化蛋白均有着相同的域结构;分析已测序细菌的趋化基因CheA的域结构发现新鞘氨醇杆菌的趋化系统属于Fla类型。鉴于趋化系统的关键核心蛋白CheA的HATPase_c和CheW两个结构域高度保守，cheA可以作为趋化性细菌的生物标志物(biomaker)，用于检测环境中的趋化细菌。
　　4.采用滴定法和游动平板法研究N.pentaromativoransF2、N.pentaromativoransUS6-1、NovosphingobiumindicumK13、NovosphingobiumstygiumDSM12445、Novosphingobiumsp.C2AC及N.pentaromativoransUS6-1质粒突变株CP-US6-1对芳烃化合物和其中间代谢物的趋化性，结果显示新鞘氨醇杆菌具有趋化性的共同特性，但趋化能力强弱因菌株而异。菌株US6-1和其大质粒缺失株CP-US6-1的趋化性比较研究发现失去降解邻苯二酚能力的CP-US6-1菌株也失去了对邻苯二酚的趋化性，US6-1的趋化性可能属于代谢依赖型。
　　5.根据趋化转运蛋白的基因序列信息设计特异性引物，采用RT-qPCR技术研究这些蛋白在菲和芘诱导下的实时表达，结果发现在菲诱导下趋化转运相关蛋白的表达量均上调;在芘诱导下，趋化蛋白激酶CheA和转运相关蛋白MFS透酶(NSU_0850)的表达下调，但甲基趋化受体蛋白MCPJ和MCP_1130表达上调。验证了US6-1的代谢依赖型趋化性，且表明甲基趋化受体蛋白能直接感应PAHs。

目录

声明

摘要

第一章 前言

1 PAHs简介

1．1 PAHs的理化性质及危害

1．2 PAHs的来源及去除

2 微生物降解PAHs的研究现状

2．1 降解PAHs的微生物

2．2 PAHs的降解机制研究进展

3 细菌趋化性

3．1 趋化反应蛋白及模型

3．2 趋化反应的分子机制

3．3 细菌对环境污染物的趋化性

3．4 趋化性与降解性关联的分子机制

4 本论文的研究内容及意义

第二章 材料与方法

1 材料

1．1 实验菌株

1．2 主要药品试剂

1．3 主要仪器

1．4 主要培养基

1．5 溶液配制

1．6 主要分析软件

2 基本方法

2．1 N．pentaromativorans F2的基因组精细图构建和分析

2．2 N．pentaromativorans US6-1基因组和转录组分析

2．3 PAHs降解率测定

2．4 疏水性测定

2．5 趋化性实验

2．6 电子传递系统活性(ETSA)和细胞密度OD600的测定

2．7 关键酶基因的表达

第三章 结果与分析

1 N．pentaromativorans F2基因组测序与分析

1．1 N．pentaromativorans F2基因组概况与组分

1．2．N．pentaromativorans F2功能基因注释与分类

1．3 N．pentaromativorans F2亲缘关系分析

1．4 N．pentaromativorans F2降解PAHs相关基因及降解率研究

1．5 N．pentaromativorans F2趋化基因及其蛋白分析

2 N．pentaromativorans US6-1趋化基因及其蛋白结构分析

2．1 Mpentaromativorans US6-1趋化基因分析

2．2 N．pentaromativorans US6-1趋化蛋白结构分析

3 新鞘氨醇杆菌属(Novosphingobium)趋化系统比较分析

3．1 新鞘氨醇杆菌中趋化蛋白的组成

3．2 新鞘氨醇杆菌中趋化基因的分布

3．3 细菌趋化蛋白CheA结构比较与分类

3．4 趋化蛋白CheA系统发育分析

4 新鞘氨醇杆菌(Novosphingobium)细菌的趋化性

4．1 新鞘氨醇杆菌对单环芳烃化合物和TCA循环产物的趋化性

4．2 Novosphingobium细菌对多环芳烃化合物的趋化性

5 N．pentaromativorans US6-1趋化转运基因表达动力学

5．1 引物特异性分析

5．2 引物扩展效率分析

5．3 菲诱导下趋化转运基因实时表达

5．4 芘诱导下趋化转运基因实时表达

第四章 讨论

1 新鞘氨醇杆菌趋化性比较分析及其与降解性的关系

2 新鞘氨醇杆菌的趋化基因及其编码蛋白的比较分析

3 N．pentaromativorans US6-1趋化转运蛋白表达分析

4 N．pentaromativorans US6-1和F2对PAHs的降解特性及其疏水性分析

第五章 结论与展望

1 结论

2 展望

参考文献

附录

附录一 参与的科研课题和待发表的学术论文

附录二 目标基因序列

1．methyl-accepting chemotaxis protein McpJ(5’-3’)

2．NSU_1130：methyl-accepting chemotaxis protein(5’-3’)

3．cheA(5’-3’)

4．cheD(5’-3’)

5．cheW(5’-3’)

6．NSU_0850：major facilitator superfamily permease(5’-3’)

7．NSU_0838：MFS transporter，DHA2 family,multidrug resistance protein B(5’-3’)

8．NSU_0680：putative ABC transport system permease protein(5’-3’)

9．16S rRNA(5’-3’)

致谢