131I标记抗NRP-1单克隆抗体在荷胶质瘤裸鼠体内分布和SPECT/CT显像研究

摘要

背景介绍：
　　放射免疫显像(radioimmunoimagine，RⅡ)在肿瘤早期诊断中占据重要地位，FDA已经批准了五种基于RⅡ抗体药物用于临床肿瘤显像。但目前，现有靶点的RⅡ分子探针面临肿瘤显像探测效能不足，并存在假阴性等诸多难题。开发针对新靶点的分子探针，是RⅡ不断发展成熟的关键所在。神经鞭毛素受体-1（neuropilin-1，NRP-1），是Semaphorin 3A和血管内皮生长因子(VEGF)的共受体，参与肿瘤血管新生，肿瘤生长和转移。它在多种肿瘤组织中高表达，并与肿瘤的恶性程度密切相关，被认为是一个很有前景的肿瘤显像与治疗靶点。但目前针对NRP-1靶点分子显像，尚缺乏有效的特异性探针，为了发展靶向NRP-1的靶向显像药物，我们实验室前期通过杂交瘤技术制备了一株靶向NRP-1的功能性单克隆抗体---A6，本课题拟采用碘131标记的抗神经鞭毛素抗体（131I-A6-MAb）做为分子探针，探讨131I-A6-MAb体外特性、在荷瘤裸鼠中的生物学分布特征及其靶向显像特性。
　　实验方法：
　　(1)我们通过用rProtein A亲和柱纯化将抗NRP-1抗体从小鼠腹水中纯化，并且通过SDS-PAGE鉴定抗体的纯度，ELISA方法鉴定抗体的亲和力。
　　(2)采用Iodogen法标记碘131和抗神经鞭毛素(Neuropilin-1 NRP-1)单克隆抗体，制备131I-A6-MAb探针，凝胶柱分离法纯化131I-A6-MAb探针，放射性纸层析法(TLC)鉴定131I-A6-MAb放化纯度，Elisa法鉴定131I-A6-MAb免疫活性，体外观测法鉴定131I-A6-MAb稳定性。
　　(3)选用U87胶质瘤细胞株，采用细胞摄取实验测定探针结合特异性，饱和结合实验测定探针结合力，细胞内吞实验测定探针内吞速率。
　　(4)建立人胶质瘤U87细胞裸鼠皮下移植瘤模型，随机分为4组，每组4只，通过尾静脉注射131I-A6-MAb7.4MBp与未标记抗体(0、2.5mg/kg，5mg/kg、10mg/kg)，并于注射后24、48、72、96和120h处死小鼠。取血、心、肝、脾、肺、肾、胃、肠、骨骼、肌肉、甲状腺及肿瘤组织，测质量及放射性计数，经时间衰减校正后计算每克组织的放射性摄取率(％ID/g)。
　　(5)将荷U87MG胶质瘤模型裸鼠随机分2组，一组为未阻断组，另一组为阻断组，每组4只，经尾静脉注射7.4MBq131I-A6MAb（即未阻断组）或与700μg未标记抗体同时注射（即阻断组），于注射后不同时间点(12、24、48、72、96、120h)行SPECT/CT显像。
　　实验结果：
　　(1)SDS-PAGE检测显示经纯化的抗NRP-1抗体A6的纯度为95％，浓度为4mg/mL;ELISA检测抗体的亲和力为原腹水结合力的76％。
　　(2)纸层析法结果计算表明，131I-A6-MAb标记率为98％，放化纯为98％;96h稳定性测试表明，131I-A6-MAb在室温下存放以及在PBS溶液中，其标记率仍然都维持在85％以上，说明其具有良好的体外稳定性。
　　(3)细胞实验显示，131I-A6-MAb可特异性结合U87MG细胞表面NRP-1抗原，并在1h时达到高峰为15.80±1.30％;其与细胞表面抗原亲和力(KD)为1.67±0.14nM，与抗原结合后的细胞内吞速率为25.7±3.0％（8h），表明了131I-A6-MAb能特异性、高亲力地结合于U87MG细胞表面NRP-1受体。
　　(4)生物学分布实验显示，131I-A6-MAb可特异性靶向肿瘤组织，未阻断组与阻断组(2.5、5、10mg/kg)，裸鼠肿瘤组织摄取在24h摄取值分别为6.0±1.2、8.8±1.7、11.4±2.0、8.2±1.4ID％/g，阻断后可提高肿瘤摄取131I-A6-MAb(P＜0.05)，其中用5mg/kg时肿瘤摄取131I-A6-MAb最高，而用10mg/kg时肿瘤摄取131I-A6-MAb就受至抑制;肝脏摄取在24h分别为7.6±1.5、6.4±0.9、5.8±0.7、6.0±0.8ID％/g，阻断组与为阻断组肝脏摄131I-A6-MAb取虽然被抑制，但差别无统计学意义（P＞0.05）;131I-A6-MAb体内放射性剂量随时间延长逐渐下降，其中在血液中清除最快，120h时各组血浆中放射性浓度分别为0.8±0.1、1.2±0.3、2.0±0.3、6.0±1.3ID％/g;肿瘤/血浆比值(T/B)在120h达到最高，为1.8±0.50、2.3±0.7、2.4±0.6、0.9±0.2，表明肿瘤组织特异性结合131I-A6-MAb，正常组织不结合或很少特异性摄取131I-A6-MAb。
　　(5)SPECT/CT显像结果显示，尾静脉注射131I-A6-MAb后12h肿瘤显影，随时间的延长，肿瘤影像越清楚，至48h时最清晰，而在700μg未标记抗体阻断后，肿瘤影像明显受抑制。提示131I-A6-MAb能特异性结合于肿瘤组织。
　　结论：
　　(1)我们建立抗NRP-1抗体亲和层析纯化方法，获得一批高亲和力的抗NRP-1抗体A6。
　　(2)我们成功制备131I-NRP-1A6b分子探针，31I-A6-MAb的标记方法简单，易行，标记率高，稳定性好，具有良好的NRP-1的靶向性和特异性，有望成为一种新型肿瘤诊断和治疗的药物。
　　(3)阻断正常组织摄取可提高肿瘤组织摄取，而5mg/kg可能为最佳阻断剂量。

目录

声明

摘要

前言

一、放射免疫显像

二、Neuropilin1-简介

2．1 Neuropilin-1起源

2．2 NRP-1蛋白结构

三、NRP1正常组织中表达及其生物学作用

3．1 NRP-1在正常组织中表达

3．2 NRP-1与生长发育

3．3 NRP-1与免疫调节

四、NRP1与肿瘤

4．1 NRP1在肿瘤组织中表达

4．2 NRP-1与肿瘤血管新生

4．3 NRP-1与肿瘤生长

4．4 NRP-1与肿瘤转移

4．5 NRP1与肿瘤干细胞

4．6 NRP1表达与肿瘤进展机制

五、NRP1共受体

5．1 VEGFR

5．2 C-MET

5．3 PDGFRS

5．4 EGFR

六、NRP-1靶点治疗现状

6．1 单克隆抗体

6．2 小分子肽

6．3 可溶性NRP1(SNRP-1)

6．4 干扰RNA

6．5 Sema3A

七、NRP-1靶点分子显像现状

八、本研究目的与内容

第一章 131I-A6-MAb的制备、纯化及鉴定

前言

一、实验材料

1．1 抗体腹水

1．2 主要试剂及耗材

1．3 主要仪器及设备

1．4 主要试剂的配制

二、实验方法

2．1 抗体纯化

2．2 131I-A6-MAb制备

2．3 131I-A6-MAb纯化

2．4 131I-A6-MAb放射性化学纯度测定

2．5 131I-A6-MAb体外稳定性观察

2．6 131I-A6-MAb免疫活性测定

三、实验结果

3．1 A6抗体SDS-PAGE分析

3．2 A6间接ELISA

3．3 131I-A6-MAb标记率

3．4 131I-A6-MAb放射性化学纯度

3．5 131I-A6-MAb免疫活性

3．6 131I-A6-MAb体外稳定性

四、讨论

第二章 131I-A6-MAb体、内外特性及SPECT／CT显像

前言

一、实验材料

1．1 实验用细胞株

1．2 主要试剂及耗材

1．3 主要实验仪器

1．4 主要试剂配制

二、实验方法

2．1 细胞培养

2．2 131I-A6-Mab细胞摄取实验

2．3 131I-A6MAb结合力(KD)测定

2．4 131I-A6-MAb细胞内吞试验

2．5 131I-A6-MAb移植瘤裸鼠生物学分布

2．6 131I-A6MAb裸鼠SPECT／CT显像

三、实验结果

3．1 131I-A6-MAb细胞摄取

3．2 131I-A6-MAb亲和力(KD)

3．3 131I-A6-MAb细胞内吞速率

3．4 131I-A6-MAb裸鼠体内生物学分布

3．5 131I-A6-MAb荷瘤裸鼠SPECT／CT显像

四、实验讨论

第三章 131I-A6-MAb裸鼠体内阻断实验

前言

一、实验材料

1．1 细胞株及实验动物

1．2 实验仪器

1．3 实验溶液配制

二、实验方法

2．1 肿瘤模型制作

2．2 阻断组荷瘤裸鼠生物学分布

2．3 阻断组裸鼠SPECT／CT显像

三、实验结果

3．1 131I-A6-MAb各组血液放射性代谢

3．2 131I-A6-MAb各组裸鼠血液放射性分布

3．3 131I-A6-MAb各组裸鼠24h生物学分布

3．4 131I-A6-MAb不同时间点各组荷瘤裸鼠肿囊代谢

3．5 各组裸鼠不同时间点肿瘤／血浆比值

3．6 131I-A6-MAb各组裸鼠48hSPECT／CT显像

四、实验讨论

五、讨论

结论

本研究存在的问题

参考文献

硕士期间发表文章

致谢