DUF1644家族基因OsSIDP409在水稻盐胁迫应答中的功能分析

摘要

水稻是世界上重要的粮食作物，也是单子叶植物研究的模式植物。它的产量受高盐、干旱、低温和高温等各种不良环境的影响，其中高盐是最主要的影响因素之一。因此，探究耐盐机理，分离和克隆耐盐基因，提高水稻的耐盐性具有重要的意义，这也是现代水稻育种工作的研究热点。
　　本研究通过基因芯片和生物信息学分析，从水稻中分离了一个DUF1644家族基因OsSIDP409，该基因编码的蛋白含有保守的DUF1644结构域和RING/FYVE/PHD型的锌指结构域;亚细胞定位显示该蛋白定位在细胞膜和细胞质。对基因编码区上游的启动子区进行预测，发现其中存在许多胁迫相关的顺式作用元件。qRT-PCR和GUS活性检测均表明该基因在水稻的各个组织/器官中均有表达，尤其在根、茎和叶中表达较强。另外，该基因的表达受高盐、干旱、H2O2、MeJA和ABA的诱导。为了进一步研究该基因的功能，构建了该基因的超量和抑制表达载体，并通过农杆菌介导的遗传转化获得了相应的转基因植株。对它们的T1代幼苗进行了耐盐性分析，发现超量表达OsSIDP409基因的植株减轻了高盐胁迫产生的氧化损伤，并且上调了胁迫相关基因P5CS、Rab16b、LEA3-1、OsNCED4以及OsbZIP23的表达量，提高了耐盐能力。而OsSIDP409基因的抑制表达植株则完全相反。另外，表达并纯化了His-OsSIDP409融合蛋白，此蛋白即可作为抗原来生产多克隆抗体，以检测盐胁迫下水稻中OsSIDP409蛋白的表达情况。
　　综上所述，OsSIDP409基因的超量表达可以提高植株的耐盐能力，而该基因的抑制表达则会降低植株的耐盐能力，暗示该基因在盐胁迫应答过程中起正向调控作用。

目录

声明

摘要

缩略词(Abbreviations)

第一章 前言

1．1 植物的耐盐机理

1．1．1 生物膜的结构和功能

1．1．2 离子区域化

1．1．3 渗透调节

1．1．4 激素调节

1．2 耐盐相关基因的克隆与利用

1．2．1 功能蛋白基因

1．2．2 与信号传递相关的基因

1．2．3 盐胁迫下植物的信号转导和基因表达

1．3 DUF1644家族

1．4 本研究的目的和意义

第二章 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 水稻材料

2．1．2 质粒与菌株

2．1．3 主要试剂与仪器

2．1．4 培养基及试剂的配置

2．2 实验方法

2．2．1 生物信息学分析

2．2．2 引物设计与合成

2．2．3 水稻材料的培养与处理

2．2．4 水稻组织基因组DNA的提取

2．2．5 水稻组织DNA的提取

2．2．6 反转录

2．2．7 实时荧光定量PCR

2．2．8 表达载体的构建

2．2．9 农杆菌介导的水稻遗传转化

2．2．10 水稻转基因植株的鉴定

2．2．11 亚细胞定位分析

2．2．12 GUS组织化学分析

2．2．13 超量及抵制表达转基因水稻耐盐性分析

2．2．14 原核表达载体的构建及融合蛋白的表达

第三章 结果与分析

3．1 生物信息学分析

3．2 OsSIDP409基因上游启动子区顺式作用元件预测

3．3 OsSIDP409基因在逆境和激素处理下的表达模式分析

3．4 表达载体的构建

3．4．1 超量表达载体的构建

3．4．2 抵制表达载体的构建

3．4．3 亚细胞定位表达载体的构建

3．4．4 组织定位表达载体的构建

3．5 农杆菌介导的水稻遗传转化

3．6 水稻转基因植株的鉴定

3．6．1 PCR检测OsSIDP409转基因植株

3．6．2 qRT-PCR检测转基因檀株中OsSIDP409基因的表达水平

3．7 亚细胞定位分析

3．8 组织表达模式分析

3．9 超量及抵制表达转基因水稻耐盐性分析

3．9．1 耐盐性实验

3．9．2 离体叶片中H2O2的检测

3．9．3 抗逆相关的Marker基因的表达分析

3．10 原核表达载体的构建及融合蛋白的表达

第四章 讨论

4．1 OsSIDP409基因的表达模式

4．2 OsSIDP409蛋白的亚细胞定位

4．3 OsSIDP409基因与檀株的耐盐性

小结

参考文献

致谢