Calcitriol通过VDR抑制晚期糖基化蛋白产物诱导的人肾系膜细胞的炎症反应和RAGE-ROS-NF-κB信号通路的活化

摘要

维生素D是通过与骨，甲状旁腺，肾脏和胃肠道的相互作用调节钙稳态，已经被用来作为糖尿病肾病(DKD)的常规用药。几个临床试验表明，维生素D在糖尿病肾病的治疗中，存在着减少蛋白尿和减缓肾损伤的抗炎作用，但其作用机制尚不清楚。而晚期糖化终产物(AGEs)在血浆和肾的积累，在糖尿病肾病中，是大家公认的促炎症分子。为了探索这种抗炎作用，我们设计实验。
　　研究目的:探寻骨化三醇减少AGEs引起的人肾系膜细胞炎症反应的机制，具体是探寻骨化三醇对AGEs引起的人系膜细胞表达白细胞介素-6(IL-6)和单核细胞趋化因子(MCP-1)和对AGE-RAGE-ROS-NF-κB信号通路的影响。
　　研究方法:通过体外制备AGE-HSA和培养人肾脏系膜细胞，在明确AGE-HSA时间依赖和浓度依赖下引起肾脏系膜细胞炎症反应后，使用或不使用骨化三醇进行干预，使用ELISA检测IL-6和MCP-1细胞上清中蛋白的表达，免疫蛋白印迹检测VDR、RAGE、核转位因子-κB的蛋白表达;实时定量-PCR检测IL-6、MCP-1、VDR、RAGE的mRNA的表达;流式细胞技术检测活性氧(ROS)的表达，免疫荧光法检测活性氧的表达和核转位因子-κB的核转位水平。
　　实验结果:在培养的人肾小球系膜细胞中，
　　(1) AGE-HSA以剂量和时间依赖的方式上调IL-6和MCP-1表达（与对照组相比，P＜0.05），而骨化三醇则以剂量依赖的方式抑制AGE-HSA诱导IL-6和MCP-1表达（与剂量0组比，P＜0.05）;
　　(2)单独以AGE-HSA处理的细胞中与对照组相比，维生素D受体的表达没有明显的差异(P＞0.05)，而用骨化三醇处理的细胞中，维生素D受体的表达随骨化三醇浓度增加而增加（与对照组比，P＜0.05）;
　　(3)AGE-HSA以时间依赖的方式上调IL-6和MCP-1表达(与对照组相比，P＜0.05)，骨化三醇通过剂量依赖的方式抑制RAGE的表达(P＜0.05);
　　(4)单独使用AGE-HSA处理细胞时，ROS表达显著增加，而在加入骨化三醇后，随骨化三醇浓度的增加，ROS的生成显著下降(P＜0.05)。
　　(5)在AGE-HSA刺激后5分钟后，磷酸化NF-κB亚基p65的表达开始增加，而这种磷酸化表达将在AGE-HSA刺激后30分钟达到最大值（与对照组相比，P＜0.05）;在加入骨化三醇后，磷酸化NF-κB亚基p65的活化被以剂量依赖的方式逐渐降低（与AGE-HSA组相比，P＜0.05）。
　　实验结论:在人肾小球系膜细胞中，骨化三醇可以通过结合并活化维生素D受体，减缓AGE-HSA引起RAGE表达和ROS的产生、抑制NF-κB的活化，进而减少AGE-HSA引起的人肾系膜细胞表达IL-6和MCP-1。

目录

声明

摘要

第一章 前言

1．1 糖尿病肾病(Diabetic nephropathy)

1．2 糖尿病肾病的发病机制(Pathogenesis of diabetic nephropathy)

1．3 糖尿病肾病与晚期糖基化终末产物的关系(Relationship between diabetic nephropathy and advanced glycation end products)

1．3．1 晚期糖基化终末产物(Avanced glycation end products，AGEs)

1．3．2 糖尿病中AGE的作用(Role of AGEs in Diabetic Nephropathy)

1．4 晚期糖基化终末产物受体(Advanced glycation end product receptor RAGE)

1．5 晚期糖基化终末产物受体与氧化应激在糖尿病肾病中的作用(Role of RAGE and Oxidative Stress in Diabetic Nephropathy)

1．6 活性维生素D(Active vitamin D)

1．7 研究设计(Experimental design)

第二章 材料与设备

2．1 细胞系

2．2 工具酶和抗体

2．3 细胞培养试剂

2．4 主要化学试剂和耗材

2．5 主要仪器

第三章 实验方法

3．1 晚期糖基化人血清白蛋白(AGE-HSA)的制备

3．2 细胞培养与处理

3．2．1 细胞培养

3．2．2 实验分组

3．3 酶联免疫吸附测定法(ELISA)

3．4 实时定量PCR(Quantitative Real-Time PCR)

3．4．1 引物设计

3．4．2 人肾小球系膜细胞细胞总RNA的提取

3．4．3 RNA的浓度和纯度的测定

3．4．4 RNA的反转录

3．4．5 Real-Time PCR

3．5 蛋白质印迹法(Western-blot)

3．5．1 蛋白提取

3．5．2 BCA法测定蛋白浓度

3．5．3 SDS-PAGE电泳

3．5．4 转膜

3．5．5 封闭与杂交

3．5．6 发光鉴定

3．6 免疫荧光染色(Immunofluorescent staining)

3．7 流式细胞技术检测ROS(Measurement of intracellular ROS)

3．8 统计分析

第四章 实验结果

4．1 IL-6和MCP-1的表达

4．2 骨化三醇诱导人肾脏系膜细胞表达VDR

4．3 晚期糖基化终末产物受体(RAGE)的表达

4．4 人肾小球系膜细胞ROS的表达

4．5 人肾小球系膜细胞NF-κB的活化检测

第五章 讨论

第六章 结论

参考文献

致谢