解析“未知”型癫痫的生物标志物hsA-miR-1275及其靶基因研究

摘要

未知型癫痫(unknown-causedepilepsy)又称隐源性癫痫(cryptogenic epilepsy)，是指在临床上表现为症状性癫痫(symptomatic epilepsy)，然而以目前的临床诊断水平又无法查出明确病因。往往在特定的年龄段起病，无特殊的临床和脑电图特征。因此，分子机理与治疗的研究不够全面。microRNAs作为内源性非编码RNA(non-coding RNA)家族的成员之一，参与调控基因的转录水平。miRNA在不同组织和发育阶段具有时空表达差异性，影响各种疾病的发生发展过程。目前，未见miRNA与未知型癫痫的相关研究报道。本文，我们首次应用miRNA芯片筛选了全血的miRNA生物标志物hsa-miR-1275。而且确定了部分靶基因MECP2，SV2A，GABA受体，离子通道相关基因等。这为临床诊断和治疗提供重要线索。
　　为此，本课题的主要工作和研究结果如下:(1)建立生物样本库。收集癫痫和正常对照人群的体液样本，包括血液、脑脊液，建立癫痫的生物样本库。(2)未知型癫痫生物标志的芯片数据初期筛选:通过microRNA生物芯片对未知型癫痫和正常对照组的血液中的microRNA进行芯片杂交，再通过芯片数据分析软件分析表达差异明显的microRNA(n=20，fold change value＞30)，其中有18个上调，2个下调，筛选出未知型癫痫的候选生物标志物。(3)对候选标志物hsa-miR-1275、miR-764的功能和靶基因分析:通过生物信息学数据库预测他们的神经生物学功能和靶基因特点。对基因进行Gene Ontology和KEGG富集分析以了解这些差异基因的生物学功能和参与的信号通路。(4)芯片数据验证。通过Taqman探针RT-PCR实验对未知型癫痫的血清和脑脊液的microRNA，进行相对定量比较。发现hsa-miR-1275在血清中高表达(p＜0.001)，在脑脊液低表达(p＜0.001)。(5)hsa-miR-1275调控靶基因MECP2的转录和表达:MECP2的3'-UTR存在多个被hsa-miR-1275靶向调控额位点，且具有较高的物种保守性。实时荧光定量PCR和蛋白质免疫印记实验结果表明MECP的转录和表达都受到hsa-miR-1275的调控影响。(6)初步探讨hsa-miR-1275可能参与的信号通路:hsa-miR-1275过表达可激活NF-κB转录水平。(7)hsa-miR-1275对细胞功能的影响:hsa-miR-1275异常表达影响神经胶质瘤细胞U251的细胞周期，进而促进细胞凋亡。
　　总之，本课题首次报道了hsa-miR-1275与未知型癫痫的相关性。其中，MECP2作为hsa-miR-1275和中枢神经系统之间的的连接点，为未知型癫痫的致病机制和分子生物学基础的研究提供新的视野。

目录

声明

摘要

第一章 前言

1．1 癫痫

1．1．1 癫痫简介

1．1．2 microRNA与癫痫的研究概况

1．2 microRNA

1．2．1 miRNA简介

1．2．2 microRNA作用机制

1．2．3 miRNA研究策略

1．2．4 microRNA与中枢神经性疾病的联系

1．3 hsa-miR-1275

1．3．1 hsa-miR-1275简介

1．3．1 hsa-miR-1275研究概况

1．4 MECP2

1．4．1 MECP2简介

1．4．2 MECP2的功能

1．4．3 MECP2和miRNA

1．5 本课题研究的目的与科学意义

第二章 材料和方法

2．1 材料

2．1．1 临床样本和细胞株

2．1．2 主要试剂

2．1．3 常用试剂的配制

1．1．4 主要仪器

2．2 实验方法

2．2．1 细胞培养

2．2．2 microRNA分离提取

2．2．3 mRNA的提取

2．2．4 蛋白提取与蛋白质免疫印迹

2．2．5 Taqman探针检测microRNA

2．2．6 miRNA mimic／inhibitor转染技术

2．2．7 荧光素酶报告基因实验

2．2．8 实时定量PCR(Eva Green)

2．2．9 细胞周期与凋亡检测

2．2．10 DAPI细胞核染色

2．2．11 生物信息学分析

第三章 结果与分析

3．1 未知型癫痫血液microRNA芯片分析

3．2 筛选差异表达最显著的microRNA

3．3 miRNA的生物功能预测

3．4 验证hsa-miR-1275在未知型癫痫患者血清中的表达

3．5 hsa-miR-1275在未知型癫痫患者脑脊液中的表达

3．6 hsa-miR-1275调控靶基因MECP2

3．6．1 预测hsa-miR-1275靶向MECP2 3’-UTR的位点

3．6．2 hsa-miR-1275减低MECP2的mRNA转录水平

3．6．3 hsa-miR-1275减低MECP2蛋白的表达水平

3．7 hsa-miR-1275抑制NF-κB的转录激活

3．8 hsa-miR-1275对U251细胞周期的影响

3．9 hsa-miR-1275对U251细胞凋亡的调节作用

第四章 讨论

全文小结

参考文献

发表论文与学术成果

致谢