Hedgehog信号和自噬在多发性骨髓瘤化疗耐药机制中的作用研究

摘要

在多发性骨髓瘤的临床治疗中，化疗耐药现象仍然是治疗失败的主要原因之一。为了更好地了解多发性骨髓瘤的化疗耐药性及相关的机制，我们建立了阿霉素(doxorubicin，DOX)耐药的细胞系多发性骨髓瘤细胞系RPMI8226/R(doxorubicin-resistant cell line)，DOX对8226/R的半数抑制率(IC50)是对DOX敏感的细胞系RPMI8226/S(chemosensitive cell line)的5～6倍。我们发现在多发性骨髓瘤耐药性的诱导过程中存在Hedgehog(Hh)信号通路的活化，即Hedgehog信号通路在8226/R中的的表达量显著高于8226/S，Hh的过表达能够诱发骨髓瘤的对化疗药物的抵抗，而阻断Hh信号通路能够逆转骨髓瘤的化疗耐药。Hh抑制剂也能干扰8226/R细胞系中P-糖蛋白(P-gp)和多药耐药相关蛋白MRP1的表达，并引起8226/R和8226/S中PI3K/AKT(phosphoinositide3-kinase(PI3K)/protein kinase B(Akt))和MAPK(mitogen-activated proteinkinase)信号通路表达量不同程度的降低，我们推断这些信号通路之中可能存在交叉作用导致耐药性的发生。最后，我们发现Hh信号通路的阻断能够显著地减少VEGF和IL-6等细胞因子在8226/R细胞系中的表达。因此，Hh信号通路是一种能逆转多发性骨髓瘤多药耐药的新靶点。
　　我们的研究表明GANT61通过阻断Gli转录子的功能而对Hh产生高选择性抑制作用，能够干扰膜结合药物转运体蛋白P-gp的表达，增强阿霉素(DOX)的细胞毒性作用，引起细胞内的DOX蓄积而对DOX耐药的8226/R细胞产生较大的逆转耐药作用。细胞周期的分析显示通过调节细胞周期相关蛋白，GANT61能够抑制MM耐药细胞的S期，并诱导G2/M期阻滞。我们用FASC分析显示相对于化疗药敏感细胞8226/S，GANT61能够诱导8226/R细胞产生更强的凋亡。Western结果显示GANT61作用于8226/S和8226/R两组细胞后，p53及其磷酸化水平，前凋亡蛋白Bcl-2家族成员在8226/R细胞中显著升高，其诱导的线粒体介导的和死亡受体介导的凋亡途径在8226/R细胞中显著激活。GANT61作用后Fas受体及其下游的caspase3蛋白在8226/R细胞的表达较8226/S细胞高。因此，我们认为Hh抑制剂GANT61能作为一种新的能够单独逆转耐药，或和其他化疗药物联用逆转耐药的有效药物。
　　已经证实自噬在多种肿瘤化疗的过程中被激活，但自噬在阿霉素(DOX)诱导的多发性骨髓瘤(MM)中的多药耐药(MDR)中所起的作用仍不甚明了。Hh信号通路在包括MM在内的许多肿瘤中异常活化，Hh信号通路能否调控自噬仍有待进一步论证。本次课题的目的在于探讨自噬在DOX敏感MM细胞8226/S和耐药细胞8226/R两组细胞系的活性差别。分别测定饥饿和Hh信号抑制剂GANT61处理后观察自噬的变化。在饥饿和GANT61处理后，AO染色、免疫荧光和Western blot结果显示，自噬活性在8226/R细胞中较8226/S组细胞中显著增高。GANT61能够显著抑制MM细胞8226/R的增殖从而逆转多药耐药(MDR)，这可能与GANT61能够在8226/R细胞中显著诱导自噬性细胞死亡(Ⅱ型细胞死亡)有关。有趣的是，当用自噬抑制剂3-MA和小干扰RNA(siRNA)沉默自噬相关基因Beclin1后，GANT61诱导的耐药细胞8226/R的凋亡显著增高。总之，我们的结果显示自噬活性的增高在DOX诱导的MM的MDR中扮演重要作用，阻断自噬与Hh信号通路能够增强化疗药物在耐药细胞中的敏感性，对临床MM病人的MDR治疗有重要的参考价值。

目录

声明

摘要

第一部分 Hedgehog信号过表达在骨髓瘤化疗耐药机制中作用的研究

材料与方法

一、材料及设备

二、实验方法

结果

1、Hh信号通路组分在骨髓瘤细胞系中的表达

2、由8226／S细胞系建立的阿霉素耐药细胞系8226／R

3、Hh信号通路在8226／R细胞系中的异常激活

4、Hh通路下游靶点和MDR相关蛋白在RPMI 8226／R中的表达

5、阻断Hh信号对骨髓瘤8226／R细胞耐药性的影响

6、Hh信号阻断剂影响骨髓瘤8226／R细胞化疗药物敏感性的机制

讨论

第二部分 靶向Hh信号途径增加骨髓瘤细胞化疗敏感性的机制研究

材料与方法

一、材料及设备

二、实验方法

结果

1、GANT61与DOX协同抑制8226／R细胞增殖

2、GANT61改变P-gp的生物学行为

3、GANT61对8226／S和8226／R细胞周期和细胞周期相关蛋白表达的影响

4、GANT61对8226／S和8226／R细胞凋亡的影响及其机制

讨论

第三部分 自噬在多发性骨髓瘤化疗耐药机制中的作用

材料与方法

一、材料及设备

二、实验方法

结果

1、饥饿条件下8226／S细胞和8226／R的自噬活性

2、阻断Hh信号对骨髓瘤细胞自噬话性的影响

3、3-MA阻断自噬增强GANT61介导的细胞凋亡

4、siRNA沉默Beclin 1表达增强DOX和GANT61对8226／R的抗肿瘤作用

讨论

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的论文