西藏林芝地区藏族人群乙型肝炎病毒血清及分子流行特征研究

摘要

乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染可以引起肝脏损害，并可以持续慢性感染，HBV长期慢性感染会造成肝硬化、原发性肝癌等失代偿性终末期肝病，从而导致死亡，是我国乃至全球最重要的公共卫生问题之一。西藏自治区地处我国西北部，早期研究认为其属于HBV高流行地区，但目前对该地区HBV流行病学以及分子特征研究较少。为了解西藏自治区慢性乙型肝炎等重要传染病的流行情况和HBV的分子流行病学现状及特征，本研究于2012年通过血清流行病学调查，研究西藏林芝地区全年龄人群慢性乙型性肝炎等重要传染病尤其是HBV感染的流行现状和影响因素，评价该地区慢乙肝防治效果，并为其进一步制定预防和控制慢乙肝流行的策略提供科学依据。
　　本研究在西藏林芝地区常住人口中采集到1945份血清样本，其中在1892份有效样本中，共检测出256份样本为HBsAg阳性，阳性率为13.49％;1413份样本为Anti-HBc阳性，阳性率为74.37％。调查人群中男性HBsAg阳性率、Anti-HBc阳性率分别为13.89％、73.63％，女性人群阳性率分别为13.19％、75.05％均无显著差异(x2=0.201，p=0.654;x2=0.499，p=0.480)。对比1992年和2006年开展的全国范围的病毒性肝炎血清流行病学调查结果，我国西藏地区的HBsAg携带率呈下降的趋势，但下降速度远不及中国其他地区。本研究显示，西藏林芝地区目前仍为HBV高流行区。自2003年西藏地区普及乙肝疫苗免疫以来，小于10岁儿童HBsAg阳性率5.71％，显著低于大于10岁人群。政府应采取扩大免疫人群等防治措施来控制乙肝流行。
　　为研究我国西藏林芝地区慢乙肝感染者HBV基因型及其分子流行病学特征，本研究从256份HBsAg阳性的样本中，选取HBV DNA定量大于105copies/mL的样本，进行全长序列的调取、测序，共得到73株HBV全长序列，与GeneBank中的HBV参考株进行核苷酸序列同源性比对分析，并绘制系统发生树分析，得到C型为5株，C/D重组型为68株，根据重组的区域不同又可分为CD1型（在700 bp左右处重组）和CD2型（在1500 bp左右处重组）。在C/D重组的序列中，CD1和CD2两组比较:基本核心启动子BCP A1762T/G1764A的突变率无显著性差异(P=0.747)，前C区A1896的突变在两基因型间也无显著性差异(P=0.585)。本研究结果显示西藏林芝地区的乙型肝炎病毒的基因型主要为CD1和CD2重组型并了解了基因突变的基本情况，为制定针对该地区的乙型肝炎预防控制策略和指导临床治疗提供了一定的参考依据。
　　另外，由于HBV基因组各开放读码框高度重叠，因此为了进一步研究该地区HBV的病毒学特征，需要构建包含1.1倍以上的HBV基因组的质粒，以实现在体外细胞模型中复制。传统构建HBV1.1倍体复制子的克隆方法涉及多步DNA酶切/连接，操作复杂，耗时较长。而本研究发展了一种基于新型克隆技术GibsonAssembly快速构建HBV1.1倍体复制子质粒的新方法，在获得HBV基因组DNA后仅需一步体外装配操作即可完成。利用该技术，成功从4份HBV感染者标本中获得HBV1.1倍体复制子，并通过瞬时转染Huh7细胞，证明其能够支持HBV的体外复制。本研究为从临床标本中快速获得HBV复制子克隆以研究病毒表型功能提供了更为高效的新方法。
　　综上所述，本研究调查了西藏林芝地区慢乙肝感染的流行情况并研究了HBV感染的分子特征，为深入了解西藏地区HBV感染并为其控制提供了必要的依据。同时发展了一种新型构建HBV1.1倍体的方法，为临床标本的功能研究提供了高效的方法。

目录

声明

摘要

缩略词

第一章 前言

1 乙型肝炎病毒

1．1 嗜肝DNA病毒科

1．2 HBV的病毒结构

1．3 HBV的基因组结构

1．4 HBV基因的编码蛋白

1．5 HBV的生命周期

2 乙型肝炎病毒的流行病学特征

2．1 HBV流行病学研究情况

2．2 HBV分子流行病学研究情况

2．3 HBV感染的自然史

2．4 慢性HBV感染的转归

2．5 HBV感染的预防

3 实验室研究进展

3．1 HBV感染的临床诊断

3．2 HBV研究模型

3．3 HBV复制子克隆构建方法

4 本研究的思路、目的及意义

4．1 西藏林芝地区重要传染病的流行病学调查

4．2 西藏林芝地区的乙型肝炎的分子流行病学特征

4．3 用Gibson Assembly的方法构建乙肝1．1倍体

第二章 材料与方法

1 材料

1．1 主要仪器

1．2 主要试剂与材料

1．3 常用溶液及培养基配制

2 方法

2．1 分子克隆

2．2 酶联免疫吸附法(ELISA)及化学发光奠联免疫分析(CLEIA)

2．3 HBV DNA全基因组序列的获取

2．4 1．1倍基因组克隆的构建

2．5．真核细胞表达与检测

第三章 结果与分析

第一部分：米林县藏族人群重要传染病的流行情况

1 调查对象基本特征

2 重要传染病的流行情况

3 第一部分小结

第二部分：HBsAg阳性者乙肝病毒分子流行病学分析

1 HBV全长基因扩增和序列鉴定

2 核苷酸序列的同源性分析

3 基因重组分析

4 CD1和CD2的临床特征和病毒学特征

5 第二部分小结

第三部分：用Gibson Assembly的方法构建乙肝1．1倍体

1 利用Gibson Assembly构建质粒结果

2 构建质粒转染Huh7

3 第三部分小结

第四章 讨论

1 流行病学特征

1．1 调查结果的代表性和真实性

1．2 西藏林芝地区人群乙肝病毒血清学流行现状和特征

2 分子流行病学特征

2．1 乙肝感染者的年龄构成

2．2 林芝地区HBV基因型情况

3 用Gibson Assembly构建1．1倍体

第五章 小结与展望

参考文献

致谢