有毒链状亚历山大藻定量蛋白质组学研究

摘要

亚历山大藻是一类在海洋中广泛分布的、能够合成麻痹性贝类毒素(Paralyticshellfish toxins，PSTs)的甲藻。近二十多年来，由亚历山大藻引起的有害（毒）藻华呈全球化拓展的态势，发生频率增加、规模扩大、危害加剧，由亚历山大藻造成的麻痹性贝毒中毒(Paralytic shellfish poisonings，PSPs)事件已经成为一个全球性的环境和健康问题，严重威胁到海洋生态系统的稳定、海洋生物资源的可持续利用和人们的生命财产安全。尽管针对甲藻PST开展了大量工作，但由于甲藻庞大的基因组及复杂的基因结构，目前我们对甲藻的产毒机理仍知之甚少。
　　本论文以有毒链状亚历山大藻（Alexandrium catenella）为研究对象，运用基于质谱的定量蛋白质组学技术—iTRAQ(isobaric tags for relative and absolutequantitation)技术，并结合甲藻转录组数据，比较研究了A.catenella有毒野生株(ACHK-T)与无毒变异株(ACHK-NT)蛋白质组、ACHK-T不同产毒时期蛋白质组以及细胞代谢抑制剂秋水仙素处理前后ACHK-T和ACHK-NT蛋白质组，鉴定、筛选差异表达蛋白，确认参与毒素合成的蛋白质及相关的生物学过程，探讨亚历山大藻PST合成的分子机制。取得的主要研究结果如下:
　　(1)运用iTRAQ定量蛋白质组学技术结合相应的转录组数据比较研究了正常培养条件下ACHK-T和ACHK-NT蛋白质组的差异表达。从A.catenella中鉴定到3，488个蛋白质，其中185个为差异表达蛋白:106个在ACHK-T中显著高表达，79个在ACHK-NT中显著高表达。ACHK-T中高表达的蛋白质主要参与碳水化合物代谢、氨基酸及嘌呤合成、蛋白质代谢等过程，包括转录、翻译、翻译后修饰、降解等;而ACHK-NT中高表达的蛋白质主要参与叶绿体、过氧化物酶体以及线粒体中的一些过程，包括光合作用、光呼吸、脂肪酸合成及β氧化、乙醛酸循环以及活性氧代谢等。这些生物学过程的差异表达表明，ACHK-T及ACHK-NT在碳和能量利用策略上存在差异，这可能与两者不同的产毒能力相关。此外，在A.catenella的蛋白表达谱中鉴定到了7个PST合成相关蛋白的21个同系物，但这些蛋白质的表达量在ACHK-T和ACHK-NT之间没有显著差异，产毒相关蛋白可能并非毒素合成过程所特有;
　　(2)流式细胞及毒素分析结果表明，ACHK-T在一天内完成一个完整的细胞周期且PST合成主要发生在G1期末期的两小时内。对ACHK-T不同产毒时期细胞蛋白质组的差异表达分析表明，PST合成可能与蛋白质翻译和叶绿素合成相关。此外，从7，232个鉴定蛋白质中共筛选到包括sxtA在内的9个PST产毒相关蛋白的42个同系物。但定量结果表明，在毒素合成最快的时间段内，除了参与毒素合成过程调控的ompR蛋白质外，其它产毒相关蛋白的表达量均没有显著变化。甲藻PST合成过程的调控机制可能与蓝藻类似，参与毒素合成过程的蛋白质可能存在翻译后水平的调节;
　　(3)秋水仙素处理显著影响了A.catenella的细胞结构、活性氧代谢、蛋白质代谢、碳水化合物代谢、生物发光以及叶绿素合成等过程。此外，秋水仙素处理也显著影响了A.catenella细胞中多个氮代谢相关蛋白以及细胞周期调控蛋白的表达，它们的共同作用将A.catenella抑制在了细胞周期的G1期。但在氮的吸收利用方面，ACHK-T和ACHK-NT对秋水仙素处理具有不同的响应机制。秋水仙素处理后ACHK-NT中参与氮代谢的谷氨酰胺合成酶的表达量显著下调。但在ACHK-T中，其表达量保持相对稳定，暗示细胞内毒素含量可能对谷氨酰胺合成酶的表达具有反馈调节的作用。为了应对氮限制胁迫，ACHK-T可能利用蛋白质降解的氮以维持细胞生存，而将原来用于PST合成的氮用于叶绿素的合成。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一章 前言

1．1 麻痹性贝毒

1．1．1 麻痹性贝毒概况

1．1．2 麻痹性贝毒类型

1．1．3 麻痹性贝毒来源

1．2 麻痹性贝毒合成机制研究进展

1．2．1 基因水平的麻痹性贝毒合成机制研究

1．2．2 蛋白水平的麻痹性贝毒合成机制研究

1．2．3 甲藻与蓝藻麻痹性贝毒合成的进化关系

1．2．4 甲藻麻痹性贝毒合成的调控因素

1．3 甲藻蛋白质组学

1．3．1 蛋白质组学概况

1．3．2 甲藻蛋白质组学研究进展

1．4 本论文研究内容及目的

第二章 链状亚历山大藻有毒野生株和无毒变异株定量蛋白质组学研究

2．1 引言

2．2 材料与方法

2．2．1 藻种培养及样品收集

2．2．2 毒素分析

2．2．3 蛋白质提取

2．2．4 蛋白质定量

2．2．5 蛋白质酶解及标记

2．2．6 肽段液相分离

2．2．7 蛋白质质谱分析

2．2．8 蛋白质生物信息学分析

2．3 结果

2．3．1 有毒株与无毒株毒素分析

2．3．2 蛋白质鉴定及重复性分析

2．3．3 蛋白质功能分析

2．3．4 差异表达蛋白功能分析

2．3．5 差异表达蛋白通路富集分析

2．3．6 产毒相关蛋白的鉴定及定量

2．4 讨论

2．4．1 有毒株中高表达生物学过程

2．4．2 无毒株中高表达生物学过程

2．4．3 毒素合成相关蛋白

2．4．4 有毒株和无毒株碳及能量利用差异

2．5 本章小结

第三章 链状亚历山大藻不同产毒期细胞定量蛋白质组学研究

3．1 引言

3．2 材料与方法

3．2．1 藻种培养及细胞同步化

3．2．2 细胞计数

3．2．3 流式细胞分析

3．2．4 毒素分析

3．2．5 蛋白质提取

3．2．6 蛋白质定量

3．2．7 蛋白质酶解及标记

3．2．8 肽段液相分离

3．2．9 蛋白质质谱分析

3．2．10 蛋白质鉴定与生物信息学分析

3．3 结果

3．3．1 细胞周期时相分布

3．3．2 产毒周期分析

3．3．3 蛋白质鉴定及重复性分析

3．3．4 蛋白质功能分析

3．3．5 差异表达蛋白功能分析

3．3．6 差异表达蛋白通路膏集分析

3．3．7 产毒相关蛋白的鉴定及定量

3．4 讨论

3．4．1 细胞周期与毒素合成的关系

3．4．2 蛋白质翻译过程

3．4．3 叶绿素合成过程

3．4．4 硫代谢

3．4．5 产毒相关蛋白

3．4．6 细胞周期相关蛋白

3．5 本章小结

第四章 代谢抑制剂作用下链状亚历山大藻定量蛋白质组学研究

4．1 引言

4．2 材料与方法

4．2．1 藻种培养及样品收集

4．2．2 细胞计数

4．2．3 流式细胞分析

4．2．4 毒素分析

4．2．5 蛋白质提取

4．2．6 蛋白质定量

4．2．7 蛋白质酶解及标记

4．2．8 肽段液相分离

4．2．9 蛋白质质谱分析

4．2．10 蛋白质鉴定与生物信息学分析

4．3 结果

4．3．1 细胞周期分析

4．3．2 毒素含量变化

4．3．3 蛋白质鉴定及重复性分析

4．3．4 蛋白质功能分析

4．3．5 差异表达蛋白功能分析

4．3．6 差异表达蛋白通路富集分析

4．3．7 产毒相关蛋白的鉴定及定量

4．4 讨论

4．4．1 秋水仙素对链状亚历山大藻细胞周期的影响

4．4．2 秋水仙素对链状亚历山大藻产毒的影响

4．4．3 秋水仙素对链状亚历山大藻其它生物学过程的影响

4．4．4 毒素合成与细胞内氮代谢的关系

4．5 本章小结

第五章 结论与展望

5．1 结论

5．2 论文特色及创新点

5．3 不足及展望

参考文献

附录

攻读博士学位期间论文发表情况

致谢