Mixed Lineage Kinase domain Like蛋白向细胞质膜的迁移定位导致细胞坏死

摘要

在最近的研究结果中，混交激酶域蛋白Mlkl(mixed lineage kinasedomain-like protein)被确认为Rip3蛋白在细胞坏死信号通路中的下游蛋白。然而，Mlkl如何在细胞坏死信号通路中行使怎样的功能，尚未明晰。通过在Mlkl基因敲除的细胞中回补Mlkl蛋白进行一系列的研究，实验数据表明，Mlkl蛋白氨基端结构域是其在坏死通路中行使功能的必要部分。在坏死过程中，Mlkl蛋白形成多聚体;或者在细胞中利用分子生物学手段人为地诱导形成Mlkl蛋白多聚体，也能够引起细胞坏死。并且，只有Mlkl蛋白的氨基端结构域，而非羧基端结构域部分的多聚，可以引起细胞坏死。进一步深入研究表明，Mlkl蛋白的氨基端结构域中的四个alpha-螺旋束，前130位氨基酸大小，是其中真正起作用的部分，它的多聚化足以引起细胞坏死。在该氨基端结构域中，第一个和第二个alpha螺旋相连接的连桥部分是Mlkl同源多聚转移和定位到细胞质膜上所必需的。Mlkl或者Mlkl氨基端多聚转移到细胞质膜上似乎能够引起钠离子内流，在Mlkl基因敲除的L929细胞中回补能够人工诱导形成多聚体的Mlkl蛋白，加药物刺激使Mlkl多聚之后，通过免疫荧光共聚焦显微镜可以观察到Mlkl多聚体向细胞质膜脂筏迁移富集，使用钠离子指示荧光染料指征胞质钠离子浓度，可以看到荧光信号的大幅度提升;而在细胞培养液中去除钠离子能够有效地延缓细胞坏死。以上这些现象在细胞凋亡中并不出现。所以我们认为，Mlkl多聚后能够转运到细胞质膜脂筏上，在质膜上，Mlkl多聚体或者依靠自己或者借助别的蛋白，使钠离子内流增加，使细胞渗透压上升，吸水，最终导致细胞膜破裂。

目录

声明

摘要

第一章 前言

1．1 细胞坏死

1．2 Mlkl蛋白

1．2．1 Mlkl蛋白结构

1．2．2 Mlkl蛋白在坏死细胞信号通路上的作用

1．3 细胞膜通透性和细胞死亡之间的关系

第二章 材料与方法

2．1 药品，试剂

2．2 DNA相关实验及其操作方法

2．2．1 真核细胞表达质粒的构建

2．2．2 大肠杆菌感受态细胞的转化

2．2．3 中等规模质粒DNA的提取(SDS-碱变性法)

2．2．4 质粒测序鉴定

2．3 细胞株的构建、培养及相关实验操作方法

2．3．1 细胞培养

2．3．2 基因敲除细胞株的构建

2．3．3 慢病毒包装

2．3．4 细胞的慢病毒感染

2．4 细胞存活率的测定

2．4．1 流式细胞仪检测法

2．4．2 CellTiter-Glo Luminenscent Cell Viability Assays

2．5 蛋白免疫共沉淀和组分分离实验

2．5．1 蛋白免疫共沉淀和免疫印迹

2．5．2 细胞质膜脂筏组分分离

2．6 免疫荧光共聚焦细胞成像

2．6．1 固定型式的免疫荧光样品的制作

2．6．2 活细胞样品的制作

2．7 全内反射荧光显微镜

2．7．1 TIRF的基本原理

2．7．2 TIRF系统设立的注意事项

2．7．3 TIRF系统的使用

2．7．4 单分子蛋白复合体的观测和定量分析

2．8 图像及数据分析

第三章 结果与讨论

3．1 Mlkl的氨基端引发细胞坏死

3．2 HBD介导的Mlkl或Mlkl氨基端聚合足以引发细胞坏死

3．3 Mlkl在坏死中形成四聚体

3．4 Mlkl向细胞质膜转移并伴随质膜破泄

3．5 完整的Mlkl氨基端四聚体迁移至质膜上是坏死的充要条件

3．6 Mlkl质膜定位引起细胞质钠离子浓度升高，最终导致细胞坏死

3．7 讨论

附录

参考文献

致谢