一种RARγ新型配体及其生物学活性的研究

摘要

视黄酸受体γ(Retinoic Acid Receptor gamma，RARγ)，作为核受体超家族重要成员之一，在生物体生长、发育、代谢、免疫、分化、增殖、炎症、凋亡等过程中均发挥着重要作用。RARγ一般与核受体RXRα形成异源二聚体形式，在细胞核发挥调控基因转录的活性。但是近年来的研究发现，RARγ以及其他一些核受体会出核与胞质中的蛋白直接相互作用进而快速参与到胞外的信号调控，发挥核受体的“非基因型作用”。因此，RARγ一直以来都是药物干预和治疗过程中重要且极具吸引力的靶点，而寻找RARγ的新型配体对于揭示RARγ新的生物学活性和作为特定疾病治疗靶点的潜能具有重要的意义。
　　本课题基于以上理念，通过报告基因筛选系统，从化合物库筛选到选择性调控RARγ的化合物XS-0005。XS-0005是一个苯基硫脲芳香类化合物，是本课题组根据之前发表的RXRα的coregulator表面结合位点的结构，利用visualscreening技术从小分子化合物库筛选并从specs公司购买获得，到目前为止还没有关于其活性的研究报道。我们在筛选的过程中发现XS-0005化合物对RARγ有特异的转录抑制作用，并通过体外实验证明XS-0005与RARγ存在直接结合。我们通过体外结合实验和Glide docking的方法推测其在RARγ上的可能结合位点和对结合起关键作用的氨基酸，结果发现XS-0005可能并不结合在核受体经典的LBP口袋，而是结合在表面coregulator的结合位置。RAW264.7小鼠巨噬细胞中，我们发现XS-0005能够抑制本底以及炎症因子LPS激活的ERK通路，其作用机制可能是通过促进RARγ与TRAF6的相互作用进而诱导TRAF6的降解。另外，我们发现在MCF-7人乳腺癌细胞中XS-0005也会诱导TRAF2的降解并抑制ATRA对AKT的激活。在生理功能上，我们发现XS-0005会使RAW264.7小鼠巨噬细胞周期阻滞在S期并诱导细胞凋亡。
　　因此，本研究揭示了一个新型的RARγ的配体XS-0005，其可能通过结合在RARγ表面coregulator的结合位点，进而调节RARγ的活性。同时，本研究揭示XS-0005新的RARγ依赖的生物学活性及可能的作用机制，即XS-0005可能通过增强RARγ和TRAF6的相互作用，进而促进TRAF6的降解和抑制ERK的激活。

目录

声明

摘要

第一章 前言

1．1 核受体概述

1．2 视黄酸受体(RAR)

1．2．1 RAR概述

1．2．2 RARγ的基因型功能

1．2．3 RARγ的非基因型功能

1．3 化合物XS-0005背景

1．4 LPS和ERK交互关系概述

1．4．1 LPS概述

1．4．2 ERK信号通路概述

1．4．3 LPS调控ERK信号通路

1．5 PI3K／AKT通路概述

1．5．1 PI3K的结构和分类

1．5．2 AKT的结构和分类

1．5．3 PI3K／AKT信号通路途径及其调控

1．6 TRAF2和TRAF6在信号通路中的角色

1．7 研究的目的，内容与意义

第二章 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 细胞株

2．1．2 试剂

2．1．3 仪器

2．1．4 菌株

2．1．5 表达载体

2．1．6 主要溶液

2．2 实验方法

2．2．1 质粒构建

2．2．2 大量原核表达蛋白

2．2．3 细胞培养

2．2．4 细胞转染

2．2．5 细胞干扰

2．2．6 Co-IP免疫共沉淀

2．2．7 Western blotting

2．2．8 流式细胞术

2．2．9 核质分离

2．2．10 免疫荧光

2．2．11 考马斯亮蓝染色

2．2．12 报告基因检测

2．2．13 表面等离子共振SPR

2．2．14 HPLC

2．2．15 荧光分光光度滴定

2．2．16 虚拟筛选法

2．2．17 统计学分析

第三章 结果与分析

3．1 XS-0005选择性调节RARg的转录活性

3．1．1 XS-0005化合物选择性调节RARg转录活性的初筛

3．1．2 XS-0005浓度依赖的选择性抑制RARγ的转录活性

3．2 XS-0005与RARγ直接结合

3．2．1 SPR法证实XS-0005与RARγ-LBD相结合

3．2．2 荧光分光光度滴定法进一步证实XS-0005与RARγ-LBD相结合

3．2．3 HPLC法定性证明XS-0005与RARγ-LBD相结合，并初步推测XS-0005与经典的ATRA配体竞争性结合

3．3 XS-0005 binding mode的初步研究

3．3．1 Glide Docking的方法模拟XS-0005与RARγ-LBD中的LBP结合值

3．3．2 Glide Docking的方法模拟XS-0005与RARγ-LBD中的Coregulator binding site的结合

3．4 在体外XS-0005对RARγ多聚体形成的影响

3．5 XS-0005的生物学活性

3．5．1 XS-0005抑制LPS激活的ERK通路

3．5．2 XS-0005促进RARγ与TRAF6的相互作用

3．5．3 XS-0005抑制TRAF6的表达

3．5．4 XS-0005抑制TRAF2的表达并抑制ATRA激活的AKT通路

3．5．5 XS-0005将细胞周期阻滞在S期并诱导细胞凋亡

第四章 讨论

4．1 报告基因是药物筛选的有效手段

4．2 XS-0005化合物能够有效结合RARγ，且其结合RARγ的方式跟ATRA可能不同

4．3 XS-0005并不改变RARγ二聚体或四聚体的形成

4．4 XS-0005抑制LPS激活的ERK通路，并且在单独处理的时候也能抑制ERK的活性

4．5 XS-0005促脏RARγ与TRAF6的相互作用

4．6 XS-0005抑制TRAF6的表达

4．7 XS-0005降解TRAF2并抑制ATRA激活的AKT通路

4．8 XS-0005将细胞周期阻滞在S期并诱导细胞凋亡

第五章 结论

附录1 中英文对照表

参考文献

致谢