约氏疟原虫配子体特异表达基因的功能分析

摘要

疟疾是由疟原虫感染导致的蚊媒传染性疾病，每年导致全球上亿人口的感染和上百万人口的死亡，严重危害人类健康。疟原虫具有宿主交替和世代交替的特点，有脊椎动物和按蚊两个宿主，无性生殖和有性生殖两种生殖方式。配子体状态的疟原虫被按蚊吸食后，先后经历雌雄配子体—雌雄配子—合子—动合子—卵囊等发育阶段，这是一个多步骤、多基因调控的复杂过程，是疟疾传播的必须阶段。迄今为止，关于疟原虫配子体阶段特异表达基因的研究相对较少，本研究将重点分析约氏疟原虫配子体阶段特异表达基因的生物学功能。
　　通过比较鼠伯氏疟原虫ANKA虫株五个发育阶段的转录谱（4h环状体时期、16h滋养体时期、22h裂殖体时期、配子体时期及动合子时期）和人恶性疟原虫3D7虫株七个发育阶段的转录谱（环状体时期、早期滋养体时期、晚期滋养体时期、裂殖体时期、配子体Ⅱ期、配子体Ⅴ期及动合子时期），我们筛选出18个基因，它们在配子体时期mRNA的表达量较之其它发育阶段均显著上调十倍以上，呈现配子体阶段特异性表达。我们在鼠约氏疟原虫17XNL虫株上找到了这18个基因的同源基因，命名为G1-G18。
　　本研究以鼠约氏疟原虫17XNL为模型，通过反向遗传学策略，采用CRISPR/Cas9基因修饰技术，构建G1-G18基因敲除载体，并通过47次独立电击转染，23次单克隆，制备G1-G18单基因敲除虫株。结果表明，共有17个基因可以实现基因敲除，并通过有限稀释法获得单基因敲除型单克隆虫株，说明这些基因的功能对于疟原虫在红细胞阶段的发育是非必须的，或者它们的功能能够被其它基因代偿;G3基因设计了多个打靶位点，电击转染11次，但依然未获得基因敲除型单克隆虫株，推测G3基因是疟原虫红细胞阶段生长发育的必须基因，发挥重要作用。
　　对获得的17个基因的单基因敲除虫株进行功能分析，选择了疟原虫生活周期中三个关键的发育节点，分别是:疟原虫在小鼠体内诱导生成雌雄配子体的能力（包括雌雄配子体率和雌雄配子体性别比例）、疟原虫蚊期动合子生成能力（包括动合子转化率和动合子正常形态比率）和疟原虫蚊期卵囊发育能力（按蚊感染后第6-7天的卵囊数量）。
　　盐酸苯肼诱导小鼠体内疟原虫配子体生成实验和体外诱导疟原虫动合子生成实验的结果表明，这17个基因的单基因敲除，不影响疟原虫雌雄配子体生成和动合子的正常发育;
　　为了分析基因敲除虫株的潜在表型，我们进一步开展了这17个基因的单基因敲除虫株的按蚊感染实验。结果显示，所有单基因敲除虫株在感染按蚊后能够形成正常数量范围的卵囊（感染后第6-7天），与野生型虫株相比没有显著差异。
　　综上所述，本研究筛选出18个约氏疟原虫配子体时期特异表达的基因（G1-G18），构建了G1-G18的基因敲除载体，获得了17个基因的单基因敲除型单克隆虫株，初步探讨了配子体时期特异表达基因的生物学功能，结果表明，本研究中的17个基因对疟原虫雌雄配子体、动合子和卵囊的发育没有影响。

目录

声明

摘要

第一章 前言

1．1 疟疾和疟原虫

1．2 疟原虫生活史(Life Cycle)

1．3 疟原虫在按蚊中肠内的生殖发育

1．4 啮齿类动物疟原虫

1．5 疟原虫配子体阶段特异表达基因(gametocyte-specific)研究进展

1．5．1 P47、P48／45和P230在雌雄配子受精过程中起到关键作用

1．5．2 Pfg377对雌配子体嗜锇小体的形成和雌配于从红细胞中的释放过程发挥重要作用

1．5．3 MDV-1／PEG3介导雌雄配子从红细胞的释放

1．5．4 gABCG2在疟原虫脂代谢过程中发挥重要作用

1．6 本研究的目的与意义

第二章 约氏疟原虫配子体时期特异表达基因的筛选

2．1 引言

2．2 基因筛选策

2．3 基因筛选结果

2．4 小结及讨论

第三章 约氏疟原虫配子体时期特异表达基因的单基因敲除虫株构建

3．1 引言

3．2 实验材料

3．3 实验方法

3．3．1 虫株感染、冻存和复苏

3．3．2 血涂片姬姆萨染色

3．3．3 疟原虫高纯度基因组DNA提取

3．3．4 疟原虫基因组DNA快速提取

3．3．5 约氏疟原虫电击转染步骤

3．3．6 有限稀释法获得单克隆虫株

3．3．7基于CRISPR／Cas9系统构建打靶载体

3．3．8 电击转染获得单基因敲除虫株

3．4实验结

3．4．1 CRISPR／Cas9系统介导的G1基因敲除

3．4．2 CRISPR／Cas9介导的G2基因敲除

3．4．3 CRISPR／Cas9介导的G3基因敲除

3．4．4 CRISPR／Cas9介导的G4基因敲除

3．4．5 CRISPR／Cas9介导的G5基因敲除

3．4．6 CRISPR／Cas9介导的G6基因敲除

3．4．7 CRISPR／Cas9介导的G7基因敲除

3．4．8 CRISPR／Cas9介导的G8基因敲除

3．4．9 CRISPR／Cas9介导的G9基因敲除

3．4．10 CRISPR／Cas9介导的G1O基因敲除

3．4．11 CRISPR／Cas9介导的G11基因敲除

3．4．12 CRISPR／Cas9介导的G12基因敲除

3．4．13 CRISPR／Cas9介导的G13基因敲除

3．4．14 CRISPR／Cas9介导的G14基因敲除

3．4．15 CRISPR／Cas9介导的G15基因敲除

3．4．16 CRISPR／Cas9介导的G16基因敲除

3．4．17 CRISPR／Cas9介导的G17基因敲除

3．4．18 CRISPR／Cas9介导的G18基因敲除

3．5 小结与分析

第四章 约氏疟原虫配子体特异表达基因的功能分析

4．1 引言

4．2 实验材料

4．3 实验方法

4．3．1 盐酸苯肼(PHZ)诱导配子体大量生成

4．3．2 动合子体外诱导转化

4．3．3 血饲按蚊感染

4．3．4 按蚊卵囊红汞染色

4．3．5 相关实验计算公式

4．4 实验结果

4．4．1 G1基因敲除单克隆虫株表型分析

4．4．2 G2基因敲除单克隆虫株表型分析

4．4．3 G4基因敲除单克隆虫株表型分析

4．4．4 G5基因敲除单克隆虫株表型分析

4．4．5 G6基因敲除单克隆虫株表型分析

4．4．6 G7基因敲除单克隆虫株表型分析

4．4．7 G8基因敲除单克隆虫株表型分析

4．4．8 G9基因敲除单克隆虫株表型分析

4．4．9 G10基因敲除单克隆虫株表型分析

4．4．10 G11基因敲除单克隆虫株表型分析

4．4．11 G12基因敲除单克隆虫株表型分析

4．4．12 G13基因敲除单克隆虫株表型分析

4．4．13 G14基因敲除单克隆虫株表型分析

4．4．14 G15基因敲除单克隆虫株表型分析

4．4．15 G16基因敲除单克隆虫株表型分析

4．4．16 G17基因敲除单克隆虫株表型分析

4．4．17 G18基因敲除单克隆虫株表型分析

4．5 小结与分析

第五章 总结与讨论

5．1 总结

5．2 CRISPR／Cas9基因修饰技术

5．2．1 CRISPR／Cas9基因修饰技术存在脱靶效应

5．2．2 降低CRISPR／Cas9基因修饰技术脱靶效应的策略

5．3 疟原虫中存在翻译抑制现象

参考文献

附图

附表

攻读学位期间发表论文

致谢