浮游植物对海水酸度和盐度下降及石油烃污染响应机制研究

摘要

浮游植物是海洋主要初级生产者，在海洋生态系统的物质循环和能量流动中起十分重要作用。由于温室效应气体CO2的加剧排放，全球变暖、海冰融化、海平面上升，导致海洋酸度和盐度下降。同时，随着海上石油开发及运输的日益发展，海洋石油泄露事故在全球各地频发，石油烃污染已成为全球主要的海洋污染物之一。
　　本文针对海水酸度和盐度下降及石油烃污染胁迫下，海洋浮游植物的生理生态响应及其对微量元素生物地球化学循环的影响的科学问题，以浮游植物生物量、抗氧化能力、脂质过氧化、光致产生活性氧等4种指标来探讨浮游植物的生理生态响应;首次以碳量子点(CDs)为示踪剂标记浮游植物细胞和荧光检测剂检测胞内活性氧和铜的含量;探讨海水酸度和盐度下降及石油烃污染对其抗胁迫能力和微量元素摄取的影响机制，获得如下主要创新性结果:
　　1.构建碳量子点荧光探针法分析浮游植物胞内外活性氧及金属配合物生物可利用性
　　目前活性氧定量分析常用的有电子自旋共振、色谱及荧光分析等。然而，电子自旋共振和色谱分析技术虽精度高，但存在需要昂贵的实验设备，实验过程复杂，检测工作量大，受限因素多等缺陷。荧光分析技术因其快速准确，灵敏度高，数据采集简化度高，显微成像分辨率高等优点。此技术在生物及化学检测中可被广泛作为高灵敏的活性氧荧光探针。本实验基于CDs荧光信号稳定、尺寸小，较其他的荧光量子点具有水溶性好、生物毒性低、易于大规模合成及功能化修饰、制备成本低廉和反应条件温和等优势，可快速简单测定浮游植物胞内外活性氧的含量。
　　应用水杨酸表面修饰的CDs(SA-CDs)，通过膜孔导入浮游植物细胞质中，水杨酸与胞内活性氧结合产生2，3-二羟基苯甲酸，其与FeCl3反应，诱发荧光猝灭，据荧光信号变化值间接测定胞内活性氧含量。SA-CDs表面酚羟基可与Fe3+快速反应生成紫色络合物[Fe(C7H6O3)6]3-，该络合物可被胞外活性氧诱导分解，颜色逐渐恢复至黄色，用比色法于波长入525检测胞外活性氧含量。胞内和胞外检测法均具线性范围广(6-9.6×105 ng·L-1和3-2400 ng·L-1)、精密度高（相对标准偏差RSD6.38％和2.19％）、检测限低(5.32 ng·L-1和1.21 ng·L-1)等优势。胞内检测法限比高效液相色谱法（同以水杨酸为捕获剂）低105倍。胞外检测法与PeroxiDetectTM Kit法检测结果不存在显著性差异且检测限低28倍。
　　以CDs为荧光检测剂，CDs对Cu2+具较高的选择特异性，因Cu2+与CDs分子中的-COOH和-NH2作用形成不发荧光的配合物导致荧光快速猝灭，据CDs荧光信号变化来测定胞内Cu2+含量。此法与国家标准法（水质铜的测定—2，9-二甲基-1，10-菲啰啉分光光度法）检测结果不存在显著性差异。将已标记的威氏海链藻(Thalassiosira weissflogii, CCMA-102)和小球藻(Chlorella vulgaris，CCMA-410)培养基中分别加入4种不同形态的铜(卟啉铜(Cu-Por)、邻苯二甲酸铜(Cu-H2Lp)、Cu-EDTA和Cu2+)，各分两组（暗处理和光照组）。结果发现:暗处理组两种浮游植物胞内CDs荧光仅能被Cu2+猝灭，说明只有Cu2+能透过膜孔进入胞内与CDs结合;铜有机配合物可被光降解为Cu2+进入胞内，诱发CDs荧光猝灭，据荧光猝灭程度，可得配合物分解速率为Cu-Por＞Cu-H2Lp＞Cu-EDTA，与配合物的吸光能力(Por＞H2Lp＞ EDTA)和稳定常数(KcCu-Por(5.92)＜Kc Cu-H2Lp(12-14)＜KcCu-EDTA(20.57))分别呈正相关和负相关，证实金属只能以自由离子形态、被动扩散方式进入浮游植物胞内。
　　2.海水酸度和盐度下降对威氏海链藻生理生态和微量金属摄取量的影响
　　以无毒的威氏海链藻作为本研究的沿海硅藻模式种，以CDs为示踪剂，通过细胞密度、蛋白质、叶绿素a(Chla)、丙二醛(MDA)、超氧化岐化酶(SOD)、碳酸酐酶(CA)和光致产生活性氧等7个指标探讨盐度(32.0、31.0、30.0、29.0)和酸度(8.10、8.00、7.90、7.80)下降对硅藻生理生态指标（如生物量、营养价值、光合作用、脂质过氧化、抗氧化能力和固碳能力）、微量金属摄取量和抗胁迫能力的影响。
　　酸度下降对Chl a、MDA、蛋白质和活性氧的影响，盐度下降对细胞密度、铜和镉摄取量的影响均存在显著性差异(p＜0.05）。在单一或者耦合作用下，CA和SOD间呈正相关，但与其他指标均呈负相关关系;盐度下降对铜、镉和锌间的影响均存在显著的正相关关系，如铜和锌间的相关系数r高达0.989;胞内外活性氧之间亦呈明显正相关关系(r=0.953，p＜0.05)。海水酸度和盐度下降耦合对细胞密度、蛋白质、Chl a、SOD、CA和锌的影响呈拮抗效应，而对MDA、铜和镉的影响呈协同效应。酸度和盐度下降降低了藻细胞抗胁迫能力，低pH和低盐度持续胁迫比胁迫终止后强，且增强随酸度或盐度下降呈先增强后减弱趋势。
　　酸度和盐度下降对威氏海链藻的影响是通过诱发藻体产生活性氧，从而降低生物量（抑制细胞生长、叶绿素a和蛋白质合成）和固碳能力（碳酸酐酶活性降低），促进抗氧化能力(SOD酶活性增强)和脂质过氧化(MDA含量上升)。
　　3.石油烃污染对小球藻生理生态及微量元素摄取量的影响
　　研究了小球藻在含或不含石油烃(WSF)培养基中30代不断繁殖后细胞中β胡萝卜素、Chl a、 SOD、 MDA、光致产生活性氧和微量元素摄取量等影响，以CDs为示踪剂，探讨WSF对浮游植物生理生态指标、微量元素可给性和抗胁迫能力的影响。
　　小球藻对WSF污染具很强的适应和耐受能力，且在持续胁迫环境下具更强的生存竞争力。胞内/外活性氧、β胡萝卜素、·OH、MDA、SOD、锰和硒两两间均呈正相关关系，但与Chl a呈负相关。WSF对对数期和稳定期SOD活性、钒、锰和砷吸附量的影响均存在显著性差异(p＜0.05，F＞Fα);当WSF持续胁迫对处于两种生长周期的细胞中锰、硒吸收量和镍、硒吸附量的影响，当胁迫终止时对丙二醛含量的影响均存在显著性差异。
　　本研究表明小球藻对石油烃污染具很强的适应和耐受能力，且在持续胁迫环境下具更强的生存竞争力;小球藻胞内/外活性氧与抗氧化能力和脂质过氧化间均呈正相关，但与生物量呈负相关。

目录

声明

摘要

缩略语中英文对照表

第1章 绪论

1．1 海洋浮游植物生理生态研究意义

1．2 海洋微量元素生物地球化学循环研究意义

1．3 海洋酸度和盐度及石油烃污染对浮游植物生理生态及微量元素生物地球化学循环的影响

1．3．1 海洋酸度对浮游植物生理生态的影响

1．3．2 海洋盐度对浮游植物生理生态的影响

1．3．3 海洋石油烃污染对浮游植物生理生态的影响

1．3．4 海洋酸度和盐度对微量元素生物地球化学循环的影响

1．4 荧光量子点在海洋研究中的应用

1．4．1 同位素示踪技术在海洋研究中应用

1．4．2 荧光量子点在海洋研究中的应用

1．5 碳量子点在生物分析研究中的应用

1．5 本论文的科学问题和主要内容

参考文献

第2章 碳量子点荧光探针法分析浮游植物胞内外活性氧及金属配合物生物可利用性

2．1 引言

2．2．材料与方法

2．2．1 实验仪器

2．2．2 CDs基本参数

2．2．3 CDs标记藻细胞稳定性及毒性测试

2．2．4 水杨酸修饰碳量子点(SA-CDs)

2．2．5 胞内外活性氧测定方法

2．2．6 金属配合物的生物可利用性分析

2．3．结果

2．3．1 CDs细胞标记稳定性和毒性分析

2．3．2 活性氧测定方法分析

2．3．3 浮游植物对铜配合物的生物可利用性研究

2．4 讨论

2．5 结论

参考文献

第3章 海水酸度和盐度下降对威氏海链藻生理生态及微量元素摄取量的影响

3．1 引言

3．2 实验部分

3．2．1 实验材料

3．2．2 实验方法

3．3 结果

3．3．1 酸度和盐度对藻细胞生理生态的影响

3．3．2 酸度和盐度下降对胞内微量金属摄取量的影响

3．4 讨论

3．5 小结

参考文献

第4章 石油烃污染对小球藻生理生态及微量元素摄取量的影响

4．1 引言

4．2．材料与方法

4．2．1 实验仪器

4．2．2 实验药品

4．2．3 0号柴油水溶性馏分(WSF)制备

4．2．4 藻种及海水来源

4．2．5 测定方法

4．2．6 统计分析

4．3 结果

4．3．1 WSF对藻细胞生理生态的影响

4．3．2 WSF对藻细胞微量元素吸附吸收量的影响

4．4 讨论

4．5 小结

参考文献

第5章 总结与展望

5．1 主要结论

5．1．1 构建碳量子点荧光探针法分析浮游植物胞内外活性氧及金属配合物生物可利用性

5．1．2 海水酸度和盐度下降对威氏海链藻生理生态和微量金属摄取量的影响

5．1．3 石油烃污染对小球藻生理生态及微量元素摄取量的影响

5．2 创新与特色

5．3 不足之处与展望

致谢

附录