体外轴向应力刺激对兔胫骨骨折部位CD34、VEGF、TGF-β1和BMP-2表达的影响

摘要

背景:众所周知，骨折愈合的过程主要是由于在骨折后出现一系列的细胞因子，例如VEGF、TGF-β1和BMP-2等等，参与了骨折端血管再生、骨痂的形成和骨痂重塑等一系列过程。应力刺激因素亦可以促进骨折的愈合速度，但是因子与应力之间的关系不甚明了。本课题研究的前期阶段，我们研发并测试了具有自有专利的叩击式骨应力刺激仪，模拟人胫骨和足跟部的受力负重情况，初步验证了轴向应力能促进骨折愈合。但体外轴向应力刺激对骨折愈合的分子机制及影响这些分子机制的各种细胞因子我们还不甚明确，随着分子生物学实验技术的长足发展，我们已找到很多合适的方式方法来探索骨折后愈合过程的分子机制，为深入的了解骨折愈合规律和种种因素对骨折愈合过程的影响提供技术保障。
　　目的:本课题的前期研究中，通过计算机仿真模拟技术模拟得到了本次实验动物兔子的初步优化轴向应力参数为15N、1Hz。在此基础上，我们建立了兔子胫骨骨折模型，实验组施加体外轴向应力刺激，对照组只做石膏固定。在拟定的时间点进行标本获取，并从影像学、生物力学和分子生物学等方面讨论轴向应力对骨折愈合的影响，分析细胞因子与骨折愈合的关系，提供轴向应力促进骨折愈合的分子理论基础，为之后的研究提供理论依据。
　　方法:取120只新西兰大白兔建立兔子胫骨骨折模型，术后立即采用高分子石膏固定，随机分为8组。实验组在术后第8天开始进行叩击式应力刺激，两天给予应力刺激1次，每次30 min，应力参数为15 N，频率1 Hz，叩击时间5s，间歇时间3s。对照组不进行应力刺激。术后第2、4、6和8周分别进行X线片拍摄、处死动物，进行标本大体观察及分子指标检测以获得观察指标，在第8周时进行生物力学检测。
　　结果:术后兔子全部存活，无并发症发生。X线片结果显示，实验组在骨折中后期的新生骨痂和重塑程度均比对照组好，骨痂量和钙化程度更高。实验组在第6周即可达到对照组第8周的愈合程度。骨愈合的Lane-Sandhu X线评分结果显示第4、6、8周观察点实验组的Lane-Sandhu评分均明显高于对照组，差异有显著性意义(P＜0.05)。三点弯曲和最大扭矩实验结果显示，在骨折术后的第8周，实验组和对照组的差异均具有统计学意义(P＜0.05)。HE染色观察显示，在第2和第4周时实验组均比对照组细胞数量多且较早出现骨小梁等骨组织。第6周的时候，实验组可见标本中出现硬骨痂，切面见外层外骨痂生长，髓腔内已有内骨痂和纤维组织。第8周的时候实验组中外层外骨痂较对照组丰富，且髓腔内可见较多的内骨痂和纤维组织，而对照组明显较少。免疫组织化学结果显示，CD34+出现较早，实验组和对照组均在第4周达到顶峰，但实验组在第2周和第4周表达量均比对照组高，差异具有统计学意义(P＜0.05)，而后的第6周和第8周两组表达量均回落，无明显差异。VEGF在全过程中均有较高的表达，两组在第4周时均达到顶峰，且在4个时间段内实验组均比对照组表达量高，差异具有统计学意义(P＜0.05)。TGF-β1两组也均在第4周时达到顶峰，第2周和第4周两个时间点的表达差异具有统计学意义，第6周和第8周逐渐回落，无明显差异。BMP-2在实验组的第2周时可检出，表达量在第6周，新骨开始形成的时候表达量较为丰富。我们发现实验组相比对照组，在时相上有所提前，表达量明显提高，具有统计学意义(P＜0.05)。在后续的Western Blot检测中，我们对标本进行了VEGF蛋白的检测，结果显示实验组相比对照组，在各时间点均有所提高，且在第4周时表达量最多，与免疫组织化学的的结果较为一致，差异具有统计学意义(P＜0.05)。
　　结论:体外轴向应力能够促进兔子胫骨骨折的愈合，其作用的分子机制主要是通过在血肿机化期招募CD34阳性细胞，在TGF-β1的诱导下，协同VEGF形成新生血管及原始骨痂，VEGF在后续的骨痂改建中起作用，BMP-2则在骨痂形成和骨组织形成过程中起着重要作用。体外轴向叩击式应力刺激能增强上述细胞因子的表达，从而更快的促进骨折愈合，愈合后生物力学强度更高。

目录

声明

摘要

缩略语表

前言

研究意义

国内外研究现状及发展情况

研究目的

1 材料

1．1 实验动物

1．2 仪器、试剂、器材和装置

1．2．1 叩击式骨应力刺激仪

1．2．2 手术相关器材

1．2．3 兔固定装置(对兔施加处理因素时固定兔后肢应用)

1．2．4 兔后肢免负重装置

1．2．5 主要药品和试剂

1．2．6 实验设备

2 方法

2．1 实验动物造模

2．2 实验动物分组

2．3 轴向应力叩击方法

2．4 放射学观察

2．5 生物力学测试

2．6 样本制备及保存

2．7 HE染色

2．8 免疫组织化学

2．9 免疫蛋白印记

2．10 图像分析

2．11 统计分析

3 结果

3．2 X线观察

3．3 生物力学测试

3．3．1 三点弯曲测试

3．3．2 扭转测试

3．4 组织学观察

3．4．1 大体观察

3．4．2 HE染色观察

3．4．3 免疫组织化学观察

3．4．4 免疫蛋白印迹观察

4 讨论

4．1 动物模型的选择及消除自身应力干扰的方法

4．1．1 根据骨折动物模型分类

4．1．2 根据骨折动物模型的应用分类

4．1．3 消除动物自身应力干扰的方法

4．2 体外应力对骨折愈合的影响因素

4．3 体外轴向应力对骨折愈合中CD34、VEGF、TGF-β1和BMP2的影响

4．4 存在问题及展望

全文结论

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表的论文