重组腺病毒介导的缺氧诱导因子-1α基因对大鼠局灶性脑缺血再灌注后HSP90及caspase-9、caspase-3表达的影响

摘要

第一部分重组腺病毒介导的缺氧诱导因子-1α基因及重组腺病毒空载体的扩增及测定
　　目的：对重组腺病毒进行有效扩增及滴度测定，为大鼠局灶性脑缺血再灌注的重组腺病毒介导的缺氧诱导因-1a（Ad-HIF-1a）基因治疗奠定一定基础。
　　方法：采用人胚肾293细胞作为包装细胞，将重组腺病毒缺氧诱导因子-1a（AdHIF-1α）基因及重组腺病毒空载体（Ad）转染入293细胞，通过GFP在荧光显微镜下观察转染效果，将已转染293细胞包装出AdHIF-1a/Ad，并进行扩增及测定病毒滴度，取得进一步实验所需重组腺病毒。
　　结果：在荧光显微镜下可见转染后的293细胞有明显的绿色荧光蛋白，扩增后AdHIF-1a滴度为：8.2×108pfu/mL，Ad滴度为：8.9×108pfu/mL。
　　结论：通过293细胞培养，能将重组腺病毒HIF-1a成功扩增，且扩增后的病毒液量能充分满足体内基因转染实验的需求。
　　第二部分重组腺病毒介导的HIF-1α基因对大鼠局灶性脑缺血再灌注后神经细胞凋亡相关基因表达的影响
　　目的：探讨重组腺病毒介导的缺氧诱导因子-1α基因对大鼠局灶性脑缺血再灌注（CIR）的保护作用机制，为脑缺血性疾病的基因治疗提供相关理论基础。
　　方法：（1）采用线栓法建立大鼠局灶性脑缺血2h再灌注1，3，15天模型，在MCAO后将带有绿色荧光蛋白（GFP）基因的重组腺病毒空载体（Ad）和重组腺病毒介导的缺氧诱导因子-1α（AdHIF-1a）注入右侧脑室，观察GFP的在侧脑室内的持续时间及表达部位。（2）行1％2,3,5――三苯基氯化四氮唑（TTC）染色观察造模是否成功。（3）采用线栓法建立大鼠局灶性脑缺血2h再灌注6、24、48、72小时模型，测定各组相应时间点神经功能缺失体征评分、病理改变（普通光镜）的变化；运用免疫组化和Western blot检测热休克蛋白90（HSP90）、caspase-9、caspase-3蛋白的表达。
　　结果：（1）右侧脑室注入Ad及AdHIF-1a后，可于右侧侧脑室内的脉络丛、侧脑室壁及室管膜观察到GFP的表达，持续15天左右。（2）神经功能缺失体征评分可见AdHIF-1α基因治疗组与CIR组、Ad组相比均有显著性统计学差异（P<0.05）。CIR组与Ad组相比无显著性统计学差异。（3）TTC染色见大脑中动脉供血区域染色呈白色，余呈砖红色，说明模型成功建立。（4）大鼠CIR后，AdHIF-1α基因治疗组与CIR组比较光镜观察各时间点病理改变明显减轻。（5）免疫组化检测大鼠CIR后的脑组织，HSP90蛋白的表达，在CIR仅见少量表达，再灌注后6小时即达高峰，随再灌注时间延长，表达逐渐下降，经AdHIF-1a基因治疗后各时间点HSP90蛋白的表达均明显增加，与CIR组及Ad组相比有显著性统计学差异，Ad组与CIR组相比无显著性统计学差异。Caspase-9、Caspase-3蛋白的表达，随再灌注时间的延长，阳性细胞表达不断增加，至再灌注24小时达高峰，48小时阳性细胞表达开始下降，经AdHIF-1a基因治疗后各时间点caspase-9、caspase-3蛋白的阳性细胞表达均明显降低，与CIR组及Ad组相比有显著性统计学差异，Ad组与CIR组相比无显著性统计学差异。（6）Western blot检测大鼠CIR后的脑组织，HSP90蛋白的表达，在CIR仅见少量表达，再灌注后6小时即达高峰，随再灌注时间延长，表达逐渐下降，经AdHIF-1a基因治疗后各时间点HSP90蛋白的表达均明显增加，与CIR组及Ad组相比有显著性统计学差异，Ad组与CIR组相比无显著性统计学差异。Caspase-9、caspase-3蛋白的表达，随再灌注时间的延长表达不断增加，至再灌注24小时达高峰，48小时表达开始下降，经AdHIF-1a基因治疗后各时间点caspase-9、caspase-3蛋白表达均明显降低，与CIR组及Ad组相比有显著性统计学差异，Ad组与CIR组相比无显著性统计学差异。
　　结论：（1）AdHIF-1α基因对大鼠局灶性脑缺血再灌注脑组织有保护作用。（2）外源性HIF-1a基因促使其下游靶基因HSP90的表达上调，抑制caspase-9、caspase-3的释放和激活，从而减少脑缺血再灌注损伤，对脑神经细胞起到保护作用。

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第一部分重组腺病毒介导的缺氧诱导因子-1α基因及重组腺病毒空载体的扩增及测定

摘要

缩略词表

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献：

实验附图：

Abstract

第二部分重组腺病毒介导的HIF-1α基因对大鼠局灶性脑缺血再灌注后神经细胞凋亡相关基因表达的影响

摘要

缩略词表

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献：

实验附图：

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致谢

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附 综述: 重组腺病毒介导的缺氧诱导因子 1α在大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤中对HSP90、Caspase等细胞凋亡相关基因的作用