适用于哺乳动物细胞基因调控的人工核酶核糖开关的设计

摘要

核酶核糖开关（ribozyme based riboswitches）是 mRNA上一段能够调控基因表达的序列，由具有不可逆自我裂解活性的核酶和能够特异性识别配体的适体连接而成。其中核酶结构域的活性受到适体结构域的别构调控，核酶的裂解使得所在 mRNA断裂，基因表达量下降。这种仅基于 RNA的基因调控系统体积小、几乎没有免疫原性，较常用的启动子诱导型调控系统具有明显的优势，尤其是它们与与 AAV等基因治疗载体良好的兼容性，都展现出广阔的应用前景。
　　现有的核酶核糖开关调控倍数过低，基础表达量较大，调控不够严谨；其基本元件的选择与结构的组装等仍需要优化，以实现基因表达性能达到最佳。目前最常用的优化方法是文库筛选。但对于哺乳动物细胞来说，筛选过程耗时长，且目的性差，不能很好地满足优化的需求。
　　基于核酶核糖开关的作用原理进行合理设计，是一种非常有前途的优化方法，但目前囿于对其作用模式认识尚肤浅，还没有合适的模型可利用。本文综合分析已报道核糖开关序列的作用机制及结果，以核酶核糖开关主要构象间的转换为核心，系统考虑哺乳动物细胞内基因表达的主要过程，构建了其调控基因表达的数学模型，希望该模型能全面解释各种核酶核糖开关的作用原理。根据该模型，本文提出核糖开关主要构象间自由能变化是基因基础表达量的决定性因素，认为此因素对于核酶核糖开关性能的优化具有更好的参考价值。
　　基于以上模型，本文设计了一种新型核酶核糖开关。为维持核酶结构域的活性，将茶碱适体连接到锤头状核酶的茎 III上，而不是已报道核酶核糖开关所常用的茎 II位置。双荧光素酶分析实验表明，新设计的核酶核糖开关在 Hela细胞中呈现出明显的正调控性能，在1000μM茶碱浓度下，海肾萤光素酶报告基因的表达水平增加90％。与已有的同类型核酶核糖开关相比，基础表达量降低了三分之二。与已有核酶核糖开关比较，新设计的核酶核糖开关性能有明显的提高。
　　我们又进一步通过点突变实验，改变核糖开关主要构象间的自由能差值，结果显示基因的基础表达量变化基本符合预期，加深了我们对核糖开关作用机制的理解。证明在哺乳动物细胞中，本文提出的模型对核酶核糖开关性能优化具有指导作用。在设计前，首先对 RNA二级结构进行预测，继而分析核糖开关构象的自由能变化，可为核糖开关的优化提供设计方向。遗憾的是，我们还没有发现自由能变化与基因调控倍数间的定量关系，这可能与细胞内环境复杂，现有软件并不能得到很好地预测 RNA结构自由能有关。

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第1章 绪论

1.1 真核生物的基因表达

1.2 哺乳动物细胞的基因表达调控

1.3 核酶核糖开关在哺乳动物细胞中的应用

1.4 核酶核糖开关与蛋白质依赖型调控系统的比较

1.5 本文研究思路

第2章 人工核酶核糖开关的设计

2.1 RNA的结构

2.2 核酶核糖开关的结构

2.3 核酶核糖开关的设计

2.4 小结

第3章 数学模型的构建与核酶核糖开关的性能优化

3.1 核酶核糖开关的性能描述

3.2 核酶核糖开关调控基因表达的数学模型

3.3 核酶核糖开关的性能优化策略

3.4 一组核酶核糖开关实例分析

3.5 已有核酶核糖开关的局限

3.6 小结

第4章 设计以Sm核酶为效应器的核糖开关

4.1 基本框架的设计

4.2 实验材料、试剂和仪器

4.3 实验方法

4.4 实验过程与结果分析

4.5 小结

总结与展望

参考文献

致谢

附录A 已知的人工核酶核糖开关序列

附录B 点突变实验SmTheoM1-7测序图谱

个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果