马蓝药效物质形成关键基因的挖掘与功能研究

摘要

药效物质是中药发挥疗效的物质基础，是中药品质的物质内涵。马蓝Baphicacanthus cusia，由其茎叶炮制而成的青黛，以福建产品质最佳，被誉为建青黛，是福建道地药材之一。马蓝的根入药称南板蓝根，为清热解毒类的代表中药。马蓝市场需求量大，种植只顾数量不顾质量导致种质资源保护缺失。道地药材是保证中药具有确切临床疗效的关键，道地药材种质资源保护刻不容缓。
　　“组学”时代的来临为我们从分子水平认识生物提供了前所未有的机遇，在技术上为研究药用植物种质资源带来了飞跃性的进步。二代测序技术的发展成熟提供了一个快速、高通量、全面解读药用植物基因水平信息的全新技术手段，为遗传信息背景零星的物种获取批量基因序列提供了有效途径。以靛蓝、靛玉红为代表的吲哚生物碱类成分是马蓝发挥药效的重要物质基础，挖掘马蓝中吲哚生物碱类成分合成途径基因并揭示其功能将为马蓝道地种质资源保护提供有力支撑。
　　研究内容及结果如下：
　　1.通过植物组织培养技术成功获得马蓝无菌苗，并在此基础上建立了马蓝快繁培养技术快速获得大量马蓝组培苗，为探索马蓝再生植株体系和毛状根体系提供丰富的外植体资源；与此同时，通过对丛生芽诱导，再生苗的增殖、生根、壮苗、炼苗条件的摸索建立了菘蓝再生植株体系，为后续进行马蓝基因体内功能研究提供补充路径。
　　2.利用Illumina Hiseq测序平台完成马蓝器官转录组测序及注释，建立了包含293666条unigenes的马蓝转录组数据库，在基础数据库比对的基础上，通过途径注释，获得了编码马蓝吲哚类途径16个催化酶的44条编码基因，本研究首次建立了马蓝基因数据库，为获取马蓝目的基因序列打下了坚实的基础。
　　3.对马蓝的内参基因进行系统筛选并对其最适内参进行验证，最终确定在所候选的内参基因中，18S rRNA为马蓝应激条件下叶片中最稳定的内参基因，UBC为非应激条件下马蓝不同器官基因表达的最适内参，本研究确定了马蓝中第一个适合的内参基因，为后续进行马蓝基因表达研究提供了基础条件。
　　4.从马蓝转录数据库中获得BcSK序列和BcDXR序列，通过RT-PCR克隆技术获得其ORF序列；SMART分析显示BcSK具有一个功能结构域，BcDXR具有三个功能结构域，进化树分析和聚类分析均显示二者与芝麻、烟草具有较高的同源性，通过构建亚细胞定位载体并对其定位分析显示二者均定位于叶绿体中；构建BcSK原核表达载体并进行蛋白诱导表达与纯化，采用双酶偶联紫外分光光度法测定蛋白活力为4.26u/g；利用类胡萝卜素累积实验证明BcDXR能使大肠杆菌pAC-BETAipi中类胡萝卜素积累增加；通过农杆菌浸染法获得BcSK过表达转基因菘蓝再生植株与毛状根，RT-qPCR分析显示转入BcSK的再生植株中目的基因表达增加29.6倍，毛状根中目的基因表达增加38.1倍，指标化合物的LC-MS含量测定结果说明了基因表达的增加促进了莽草酸途径的合成代谢；同法获得BcDXR过表达转基因菘蓝毛状根，目的基因表达增加14倍，LC-MS含测结果亦证实了BcDXR能够在萜类途径中发挥作用。
　　综上，本研究从马蓝组培、转录组测序、内参筛选到基因功能首次展开了马蓝药效物质形成关键基因的挖掘与功能研究工作，可为揭示马蓝药效物质合成途径及马蓝道地种质保护提供参考。

目录

声明

第1章 引言

1.1 马蓝研究概况

1.2 药用植物生物碱次生代谢研究进展

1.3 药用植物有效成分生物合成途径研究体系与技术的进展

1.4 研究内容和技术路线

第2章 马蓝快繁与菘蓝再生植株体系研究

2.1 材料与试剂

2.2 实验方法

2.3 结果与分析

2.4 小结与讨论

第3章 基于Illumina平台的马蓝器官转录组学研究

3.1 材料与试剂

3.2 实验方法

3.3 结果与分析

3.4 小结与讨论

第 4 章 马蓝稳定内参基因的筛选

4.1 材料与试剂

4.2 实验方法

4.3 结果与分析

4.4 小结与讨论

第 5 章 BcSK基因的克隆与功能研究

5.1 材料与试剂

5.2 实验方法

5.3 结果与分析

5.4 小结与讨论

第 6 章 BcDXR基因的克隆与功能研究

6.1 材料与试剂

6.2 实验方法

6.3 结果与分析

6.4 小结与讨论

总结与展望

参考文献

致谢

附录A

附录B

个人简历、在学期间发表的学术论文及研究成果