南瓜蛋白诱导K562细胞凋亡的分子机制及协同STI571抗K562细胞作用的研究

摘要

药物治疗是恶性肿瘤的三大疗法之一。近年来，诱导凋亡和分化疗法为肿瘤的药物治疗开辟了新的途径，也取得了一定成效，但仍缺乏理想的诱导凋亡和分化的药物。对天然活性物质进行抗肿瘤作用的研究，尤其在诱导凋亡和分化方面进行探索，将有助于获得理想的抗肿瘤药物。 植物来源的核糖体失活蛋白(ribosome-inactivatingproteins，RIPs)具有抗生育、抗病毒和抗肿瘤等多种生物学活性，其抗肿瘤活性尤其受到关注。南瓜蛋白(Cucurmosin)是本课题组从南瓜的瓜瓤中提取的一种新的RIP，本文将对其体内外抗肿瘤活性及抗肿瘤机制进行研究，旨在为其潜在的抗肿瘤临床应用提供理论基础和实验依据。 一、Cucurmosin体内外抗肿瘤活性及诱导K562细胞凋亡的研究 体外试验(invitro)结果表明，Cucurmosin对人慢性粒细胞白血病细胞株K562和小鼠黑色素瘤细胞株B16具有较强的杀伤作用，呈明显的量效和时效关系。MTT法检测表明，阳性对照药天花粉蛋白(TCS)抑制K562细胞增殖的ICso值比Cucurmosin大4倍多，提示Cucurmosin对肿瘤细胞的体外杀伤作用强于TCS。 体内试验(invivo)结果表明，Cucurmosin对小鼠B16黑色素瘤和Lewis肺癌移植性实体瘤具有明显抑制作用，作用呈剂量依赖性。对B16黑色素瘤和Lewis肺癌的最大抑瘤率分别为55．2％和65．5％。用药期间未观察到明显的毒性作用，说明Cucurmosin具有良好的体内抗肿瘤活性。 以K562细胞作为研究对象，观察Cucurmosin促凋亡作用。形态学观察(AO／EB荧光双染法、电镜超微结构观察)发现，K562细胞出现染色质浓集、核固缩、核碎裂及凋亡小体等典型的凋亡形态学改变；DNA琼脂糖电泳显示DNA有特征性“梯级”断裂：流式细胞仪DNA倍体分析检出典型的亚二倍体(sub-G1)凋亡峰。Cucurmosin(2．5ug／m1)作用24h、48h和72h，凋亡率分别为17．2％、35．5％和47．9％，呈明显的时间依赖性。上述结果充分说明，Cucurmosin具有诱导K562细胞凋亡的作用。 二、Cucurmosin诱导K562细胞凋亡分子机制的探讨 K562细胞是一种人慢性粒细胞白血病(CML)细胞株，对化疗药物诱导的细胞凋亡具有很强的抵抗性，而抗凋亡机理主要与其P210bcr／abl蛋白具有很强的酪氨酸激酶(tyrosinekinase,TK)活性有关。通过抑制bcr／abl融合基因表达或下调P210her／au蛋白水平，或拮抗其TK活性，将有效促进K562细胞凋亡。Westernblot结果显示，Cucurmosin显著下调K562细胞P2lobcr／abl蛋白水平，呈明显的时间和浓度依赖性。RT-PCR结果显示，Cucurmosin对K562细胞bcr／ablmRNA表达无明显影响。热休克蛋白90(Hsp90)是P210bcr／abl蛋白的分子伴侣(molecularchaperone)，对P210bcr／abl蛋白具有保护作用。Westernblot结果显示，Cucurmosin下调K562细胞Hsp90表达，这将促使P210bcr／~U蛋白降解。因此，我们推测Cucurmosin下调P210bet／au蛋白水平与其具有核糖体失活活性及下调Hsp90表达有关。 已知促凋亡因子诱导肿瘤细胞凋亡的信号通路主要有两条：死亡受体激活通路和扰乱线粒体功能通路。我们研究发现，K562细胞在Cucurmosin作用下线粒体跨膜电位(△ψm)呈时间依赖性下降，同时胞浆Cyt-c浓度明显上升，caspase-3被活化，说明Cucurmosin可通过干扰线粒体功能促使K562细胞凋亡。在线粒体凋亡通路中，Bcl-2家族起着重要的调控作用。Westernblot结果显示，Cucurmosin下调K562细胞抗凋亡蛋白Bcl-xL表达，同时上调促凋亡蛋白Bax表达。 此外，Westernblot结果显示，Cucurmosin下调c-Myc表达，作用呈时间依赖性。 三、Cucurmosin与STl571的体外联合抗K562细胞作用 Cucurmosin可下调K562细胞P210bcr／abl蛋白水平，STl571对K562细胞P210bcr／abl的酪氨酸激酶(TK)活性具有竞争性抑制作用，提示两药通过不同方式对K562细胞P210bcr／abl的TK活性将产生双重抑制作用。因此，我们推测两药具有协同抗K562细胞的作用。MTT法显示，Cucurmosin与STl571合用对K562细胞增殖的抑制率大于两药相应浓度单独应用的抑制率，大多数联合用药组合q值>1．15，表明两药合用对K562细胞体外杀伤有协同作用。流式细胞仪检测表明，两药具有协同促K562细胞凋亡的作用。Westernblot结果显示，Cucurmosin和STl571联合用药，对K562细胞p210bcr／abl蛋白自身酪氨酸磷酸化的抑制作用比两药单用更为显著，说明两药对K562细胞P210bcr／abl蛋白的TK活性具有双重抑制作用，这也是它们发挥协同作用的主要原因。 综上所述，Cucurmosin具有较强的体外抗肿瘤活性和良好的体内抗肿瘤活性；Cucurmosin可有效地诱导K562细胞凋亡，促凋亡机制与其下调K562细胞P210bcr／abl蛋白水平和下调c-Myc表达等有关，促凋亡信号通路主要是线粒体依赖性，这与其下调K562细胞Bcl-xL蛋白表达和上调Bax蛋白表达有关；Cucurmosin具有协同STl571抑制K562细胞增殖及促其凋亡的作用。

目录

摘要

前 言

第一部分南瓜蛋白体内外抗肿瘤活性及诱导K562细胞凋亡的研究

第二部分南瓜蛋白诱导K562细胞凋亡分子机制的探讨

第三部分南瓜蛋白与STI571的体外联合抗K562细胞作用

结 论

参考文献

致 谢

核糖体失活蛋白抗肿瘤作用的研究概况